微型全化学分析芯片分析毒性重金属离子（1）

1 绪  论
1.1 mTAS的基本概念及其特点
20世纪90年代，分析化学家提出了微型全化学分析系统(Micro-total chemical analysis system, mTAS)的概念[1,2]。其含义是在距离检测点很近的地方完成样品所有的处理步骤的微分析系统。涉及到一个分析方法中所有部件的微型化，如泵、阀、流路、反应室、检测器以及相应的电子设备等。mTAS的核心在于将取样、预处理、分离、反应及测定这几个必经的分析步骤集成在一几平方厘米的微芯片上[2,3,4]，芯片上管道依据测定体系中待测物所需的化学反应的过程并结合微结构的特性进行设计。体系的取样点可以非常接近待测体系，这可减免分析过程中样品转移，从而高效、快速地完成试样的取样、分离、分析及检测。mTAS的分析管道一般仅为几微升或更低，对检测器的要求较高，目前常采用光学检测方法和灵敏度较高的电化学检测。响应时间快、试样和试剂耗用量低，易于自动化在线和遥控操作等特点[5]使得mTAS将成为连续监测化学工业及生化过程中化学品浓度的理想方法，在许多方面都具潜在的应用前景[6,7]，如生物过程[8]、环境及药物科学[9]、控制过程[10]，以及连续监测日益重要的有关领域[11,12,13,14,15]。对被分析物在极低浓度下监测还可以帮助诊断过程中的问题，即减少对系统外实验室的依赖。理论和实践都证明，mTAS最重要的不仅是其尺寸的大小，而是其高效性、集成化和自动化的性能。
1.2 mTAS的研究现状
自从20世纪90年代初以来，国外就展开了对mTAS的有关研究工作，并且得到了分析化学家的认同和关注，目前已成为化学和生物化学等学科的前沿之一。已有的研究[2,16]表明微型化过程除了可以减小试剂和样品用量，缩短分析时间，提高分离效率的基本特征外，更突出的优越性是改善分析操作，提高组件集成度，增大结果输出率并易于自动化。国内从20世纪90年代末逐步开始进行了mTAS的研究，但是其对mTAS研究的概念极为狭窄，主要是毛细管电泳(CE)的缩微化。不论是国内或国外，真正体现mTAS的设计思想的研究较少且不成熟，正因如此，相关研究蓬勃兴起。
1.2.1 CE缩微化的研究
毛细管电泳分析自从20世纪80年代末出现以来，以其特殊性能和功用在分析化学中占据了极为重要的地位。毛细管的特点是，容积小；侧面积与截面积比大，因而散热快、可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质，在溶液介质中能产生平面形状的电渗流。毛细管电泳因此有许多突出的优点，高效、快速，分离模式多；分析对象广，小到无机离子大到整个细胞；操作可高度自动化；样品与试剂消耗少，运转费用低。CE的高分析速度已是事实，但在很多生化反应、生产流程中的质量控制分析等都需要更快的分析速度，进一步提高CE的分析速度将会产生深刻的影响。随着mTAS概念的提出，大量研究者把mTAS的概念首先应用到了CE上，因为CE的特点很容易实现微型化，而且缩微化后可以减少操作高电压带来的危险，可以把CE上万伏的电压降到几千伏，同时不损失分离效率。
在国外学者的研究中，CE缩微化运用在分析测试中可说是层出不穷，缩微化中用到的方法的独特也让人赞叹。如Manz等[17]在微芯片上实现的同步循环毛细管电泳(SCCE)，在芯片上刻蚀出井字形的槽道，大大提高了分离的塔板数。Wolley等[18]在芯片上刻蚀出并列的多根分离管道，同时进行分离，叫做分离阵列(separating capillary array)。Simpson等[19]制作了能同时检测上百个样品的毛细管基因分析阵列，提高了输出信息的密度。CE的微型化具有高效、快速、样品试剂用量少等优点。从上世纪90年代初以来，微型化CE在DNA分析和测序、氨基酸和蛋白质的分离、免疫测定、生物细胞研究等领域[20,21,22]发挥作用。Jacbons等[23]采用简单交叉式结构玻璃芯片，在1.5 kV/cm的外加电场以及不同的分离长度下对荧光染料Rhodamine B和Fluorescence进行了分离，并采用激光诱导荧光检测。Jacbons等[24]在同一芯片上进行了细胞降解、多重PCR放大及电泳分离，整个过程只需3min。Effenhanser等[25]用相似设备分离了荧光标记的氨基酸，14 s内可实现5种中性氨基酸的基线分离。Regnier等[26]报道了微芯片上的填充柱毛细管电色谱(CEC)，这种方法采用微机械技术在石英片上刻蚀单刻蚀石英柱来解决装填问题，分离管道由硅柱间相互连接的微管道组成，使用此结构实现了Rhodamine 123的毛细管电泳分离。化学反应器可以很容易组合到微芯片上，并且反应体系死体积很小。Fluri等[27]研究表明，设计合理的混合装置对反应器的有效性十分重要，他们采用Y型混合装置混合氨基酸溶液和荧光标记试剂OPA，在20 s内产生约90000塔板数，并估算了反应器的几何形状可能会引起10％的塔板数的下降。Harrison等[28]使用毛细管电泳芯片研究了人血清中茶叶碱免疫测试方法。Effenhanser等[29]在充满非交联的10％T聚丙烯酰胺的微管道系统中按体积大小分离了磷硫代寡核苷酸盐(Phosphorothioate oligonucleotide)。Woolley和Mathies等[30]用9％的T聚丙烯酰胺筛分介质填充微制造的电泳管道，进行DNA测序。聚合酶链反应(PCR)允许在有如整个人类基因库的复杂混合体系中将所有特殊的核酸序列进行放大，但其热循环速度受试验条件限制。Zhang等[31]设计了一种新的微芯片，集成了毛细管电泳/电喷射质谱(ESI-MS)，并且可以进行自动取样。Kopp等[11]提出的连续流动PCR微芯片极具特色，放大了大的DNA样品中特殊的DNA序列。Harrison等[32]对细胞的电渗转移进行了研究，血红细胞在几百毫秒内由十二烷基硫酸钠按要求实现了有效的分析。Schmalzing等[33]以微芯片毛细管电泳装置检测了p53压制基因上单核苷酸多晶型(SNP)位置，比常规毛细管电泳快10～50倍。Wang等[34]制作PMMA芯片电泳装置，同时集成了电化学检测方法。
国内在CE缩微化方面的研究在20世纪90年代后期开始起步，但是，研究范围极为狭窄，用于实现分离的芯片管道的设计较为单一。吴友谊等[35]在有机玻璃上刻蚀微管道后，嵌入一段6cm长的毛细管作为分离通道，采用三电极体系柱端检测了1´10-4 mol/L的多巴胺(DA)，具有良好的重现性，并在该系统上分离了邻苯二酚(CA)和多巴胺的混合物。印燕等[36]设计了单片集成毛细管区带电泳分析器，对2种色素的分离中，在100 V/cm的电场下，理论塔板数可至40 000。汤扬华等[37]利用微细加工技术在玻璃上刻蚀了十字型的电泳芯片，测试了微管道的伏安特性曲线。在该系统上进行了注样和分离试验，采用激光诱导荧光法进行了检测，利用CCD拍摄了进样和分离的全过程。
mTAS概念提出后，CE缩微化是毛细管电泳发展的必然趋势[38,39]，大量的毛细管电泳研究者都把研究目光投在了CE的缩微化上，以前定期召开的国际和国内毛细管电泳会议已经把mTAS作为主题纳入。
1.2.2 FIA缩微化的研究
流动注射分析(FIA)的出现打破了人们过去一直认为进行连续流动分析最基本的前提条件为空气间隔、样品与试剂均匀混合达到稳态。FIA并不追求化学反应的平衡，它只追求一个样品有什么变化，任何其他的样品也有相同的变化。因此可以说FIA是以下三条原理的组合[40]，样品注入、受控制的分散、可重现的时序。FIA增强了分析化学的溶液处理技术，大大提高了分析化学的自动化程度。FIA的管道半径一般为0.5 mm，要使样品从注入到检测有一定信号，需要一定的管长。假如FIA中分析时试剂是很贵重的生物样品时，将会消耗掉大量的贵重生物试剂。这使分析化学家想到了FIA的微型化，Tijssen[41]第一次指出并计算了FIA管道半径从毫米降到微米的结果。FIA微型化有一些不容置疑的优点。由于反应器体积与管道半径的平方成正比；径向混合速度反比于管道半径的平方；采样频率与管道长度的平方根的倒数成正比。因此，FIA的缩微化对样品和试剂的消耗非常小，而且采样频率很高。在20世纪80年代中期研究者就提出了FIA的缩微化[42]，但是由于当时技术条件不成熟，如FIA缩微化后，载流的驱动将会需要高压，对泵的性能要求较高，而且检测器的响应存在极限问题。20世纪90年代初，随着微型全化学分析系统概念的提出，人们再次把目光转移到了FIA上[43,44]。FIA缩微化后，样品注射、反应、检测等将会被集成到微芯片上，在这其中，载流流动的驱动泵、混合管路、反应室、检测点等是设计时要重点考虑的因素。Manz等[45,46]在这方面做了大量卓有成效的工作，其利用多个硅微泵集成在硅芯片上，各个泵分别用来注样、驱动、注入试剂等，实现了无阀微系统，对水溶液中磷酸盐进行了分析。同时，通过层叠多层芯片的技术可以实现多流路微系统。由于FIA缩微化时，载流输送泵和阀等关键部件的集成在现阶段的条件下虽然可以实现，但微泵和阀等机械传动装置的制作非常困难，同时其在微液流路中的影响复杂，使其微型化应用受到一定限制[44]。为了避免集成微型泵等机械部分的困难，发展以电渗流(EOF)为基础的微型流动注射分析系统变得活跃起来。FIA缩微化技术和分离技术的密切关系，使得在将来可能会产生混合系统。生物技术传感器在微型化FIA技术中发展最快[47]。如DNA片段分析[48]、免疫分析[19,49]、基因分析[50]等。将来的研究还应包括现有的方法，如质谱(MS)和核磁共振波谱(NMR)。同时，使FIA的缩微化向连续流动化学处理过程(CFCP)发展是一种较好的方向，Manabu Tokeshi等[50]就使用CFCP在微芯片上集成微处理单元、多支流汇合进行了Co2+等离子的检测。
1.2.3 mTAS的进样与分离特性
mTAS的进样方式主要分为电动进样与压力进样，也有利用聚合物的溶胀性质进行流体进样[51,52]以及空气驱动流体运动[53]。mCE的进样方式一般采用电动进样，电动进样简便，电压易于在驱动载流和进样上切换，更易于实现CE的微型化。电动进样分为收缩进样(Pinched sample loading)和门进样(Gared Injection)。门进样应用得较多，先在样品池和样品废液池之间加一定的电压，为了抑制样品和缓冲液之间的扩散，在缓冲液池上也加上一定的电压；进样时，在废液池和样品池之间加上一定的电压，而让缓冲液池断电，此时，样品废液池上仍保持一定的电压，因此一段样品就从十字交叉口进入分离槽道。进样一定时间后，把电压又回复到分离管道。收缩进样与门进样的区别在于加电压进样时，缓冲液池也加一定的电压。因此，门进样和收缩进样的样品带的形状是不一样的。门进样的样品呈长方形，而收缩进样的样品带为梯形。收缩进样的样品体积与电场强度和时间无关；门进样可以实现连续进样，这对需要连续进样和分离的模式非常有用。由于流体的流体力学特性，因此压力进样没有象电动进样那么应用广泛。在微尺度下，驱动流体需要极高的压力。而且微泵的机械性能也是问题，在微芯片应用微泵较难控制。有时，泵输送液流的脉动性是非常大的。但是，压力进样没有电动进样中的高电压，减少了危险，在一些连续流动体系中还是应用较多。
mCE的分离主要是在电场的驱动下进行，微管道中电渗流带动溶液整体运动，各种离子或分子由于电性质的差异而得到分离。在mCE中，当在一定的电压下，样品被装载入微管道中后，切换电压到分离管道即可进行样品的分离。而在压力驱动的mTAS中，样品一般在芯片外进行预处理，处理后的样品在芯片上只是起到混合，反应，检测的作用；或者在芯片上集成微分离柱，样品进入后，先在微柱中进行分离，然后和试剂混合反应以给出信号。有时也在芯片管道中加入一种试剂以掩蔽干扰物[54]。总之，在mTAS中，mCE和mFIA进样方式没有严格的界限，在mCE中可以应用压力进样，在mFIA中也可以应用电动进样。
1.2.4 mTAS中的检测方法
由于在mTAS中，样品体积很小，通常为微、纳升级，因此对检测器的要求很高。主要有光学方法和电化学方法，光学方法主要有激光诱导荧光(LIF)[23,25,55,56]，化学发光(CL)，光度法[57]，直流等离子体分子发射光谱[58]；电化学方法[59,60,61]主要有安培法、电导法等。目前质谱检测法(MS) [31,62,63]在蛋白质分析中发展迅速。
化学发光检测作为一种分析化学测试方法，发展迅速，因其不需要激发光源，简化了仪器的设备。化学发光检测是一种暗背景下的光检测，灵敏度高，选择性好，故在mTAS分析中也得到应用。Hashimoto等[64]以微芯片毛细管电泳方法分离了多种丹酰氨基酸，使用在线化学发光进行了检测。徐溢等[59]使用化学发光方法在线检测了水中Cr(III)。Arora[65]用两片聚甲基丙烯酸甲酯中间夹乙酸酯薄膜电极的方式制作了体积为纳升级的电致化学发光(electrochemiluminescence, ECL)检测池，采用三(2,2′二吡啶)钌(Ⅱ)与三丙胺在铂电极上的电致化学发光反应，在100 nL体积下检测三丙胺，检测限为0.5 pmol·L-1。Mangru与Harrison等[66]在玻璃芯片上进行毛细管电泳分离后的化学发光检测，利用了辣根过氧化氢酶 (HRP)催化Luminol和H2O2的化学发光反应，通过检测免疫反应产物中的HRP标记羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)间接测定了鼠IgG。反应试剂Luminol加在分离缓冲液中，而H2O2在分离通道出口汇入，在反应通道中的化学发光用PMT检测。
用于在mTAS中检测的其它方法应用较少[67]。原则上，分析化学中的检测方法都可以应用在mTAS中进行检测，但是由于mTAS的特性，并不是每种方法都可行，这要考虑mTAS的检测体积、信号大小、干扰、系统集成度等因素。分光光度检测器结构简单、价格低廉，但是其对检测样品的光程长度有要求，在mTAS中由于微管道的微小，光程长度是极其短的，使其在应用中受到了限制，这只有通过对mTAS管道的特殊设计来达到要求；化学发光方法灵敏度高、装置简便、无需激发光源，分析的线性范围较宽。但是化学发光方法选择性不高，有时需要与分离系统结合。激光诱导荧光方法灵敏度高，其和质谱检测方法一样，价格昂贵，而且也需要激发光源。电化学检测方法简单，无分光光度检测中折射效应干扰，且容易集成在mTAS中。但是电化学方法中电极易受被测溶液中污染电极物质的影响，使重现性和稳定性较差。在mTAS中，应用较多的检测方法还是激光诱导荧光检测、电化学检测、化学发光检测方法。
1.3 课题研究内容、目的及意义
综上所述，mTAS自从20世纪90年初出现以来，发展迅速，有可能被用于生产与过程的在线监控、生命科学、环境科学等许多领域。目前，应用于生物样品方面的测定较多。灵活多样性和广泛的适应性预示着它的应用前景十分广阔，它将促进分析仪器在微型化的基础上更加简易化、专用化、便携化和智能化，进入生产、病房乃至千家万户，分析科学将空前普及，使分析实验室走进真正的绿色时代。
本文从微型全分析化学系统微型化过程的理论入手，讨论流体的微尺度效应，借助色谱理论及简单流体力学方程，论证缩微化的可行性及优越性。以此设计mTAS微反应结构，考察其中物质的混合及反应状况，通过具体反应体系实验来了解该微结构性能及其中化学反应的实现。设计优化微管道的微芯片，探索简易的制作微芯片的方法。组装mTAS系统，选定环境中有毒重金属离子为测定对象，通过化学发光检测方法，测定环境中有毒重金属离子的含量及形态。为最终实现mTAS整个体系的集成，为实际环境及生化体系的测试打下基础。微全化学分析系统(mTAS)研究涉及物理化学、分析化学、环境监测、生物化学、光电制造技术等学科领域，是科学技术发展到今天，多学科交叉的结果。因此，对其研究将会促进相关学科的发展。