微型全化学分析芯片分析毒性重金属离子（2）

 mTAS缩微化理论及设计原理 2.1 mTAS缩微化理论

 2.1.1 微流体的尺度效应讨论流体在管道中的流动状态一般用雷诺数Re来衡量[68]。 Re=4rQ/p2Rh (2-1) r为密度，R为管道半径，Q为体积流速，h为以泊表示的粘度。mTAS中微管道的半径(假设为圆形管道)一般在200 mm以下，Q一般小于1mL/min，因此，雷诺数小于20。故流体流动状态为很明显的层流。同时，由于流体的质量正比于R3，表面积正比于R2，微管道表面的影响相对增强。雷诺数又代表惯性力与粘性力之比，随着管道尺寸的减小，粘性力的影响将会增强。因此，表面张力对微管道中流体的运动将会产生重要影响，流体在圆直管道中运动时产生的压力差： (2-2) 为表面张力系数( water=7.3´10-2N/m)；r为微管道半径； 为流体液面与管壁的接触角。假设取 ＝0o时，则当管径为200 mm时，产生的压力差为1.46 kPa，而当微管道内径进一步降低为20mm时，压力差可高达14.6kPa。管道缩微化后要考虑管流的阻力大小，在一般的工程流体力学中，直圆管中的层流流动规律一般由Poiscuille公式[84]表述。流量： (2-3) 则沿管路的压力损失 为： (2-4) (Re雷诺系数，d管径，l管长， 流体密度，v流体流速，h流体粘度)。从公式2-4可看出，压力损失与管径平方成反比，与管长成正比，与流速成正比。对一管径2 mm，长20 cm的管道，假设流体流速为5 mm/s，则产生的压力损失为78.4Pa，若将管径降低为200 mm，则产生的压力损失将达7.84 kPa。进一步将管径降低到20 mm，产生的压力损失高达784 kPa。因此，在设计微管道时，特别是在压力驱动流体运动的情况下，要考虑管道缩微后泵的性能及芯片的耐压性能。

 2.1.2 mTAS的色谱理论探讨微管道中扩散传质过程的加快是mTAS分析效率提高的最重要的原因。但是，管道的缩微而引起的微结构中液流状态的改变及流体参数的表述，与常规体系相比有所不同，这对化学反应微结构的设计、衡量及评判微芯片的效能极其重要。在具有Poisseuille流动特性的体系中，降低管道长度将降低层流方向样品带的分散。而降低管道半径将使流体中由扩散产生的径向混合速度加快，当管道长度和流体速度进一步降低时，该效应变得更加显著。径向扩散使层流线上的分子在流线之间进行传质，这使得流线上各个分子处于不同的流速。假如样品塞在流体中的留存时间足够长，所有分子都将有机会同等出现在所有流线上，此使得流线上所有的分子都有一个平均速度。当管道中充满不可压缩的流体时，在一定的压力降下，流体的流速为[16] (2-5) 流体在微管道中维持一定线流速时，单位长度的压力降为: (2-6) ηm为流体的粘度(N×s/m2)， 平均线性流速(m/s)，L为微管道长度(m)，dc为微管道内径(m)。对于CE中的电渗与电泳运动，某种离子的迁移速度由以下方程给出： (2-7) U为电压(V)，L为微管道长度，μ是在一定条件下一个组分电渗和电泳运动的矢量和。在色谱毛细管柱中，样品的组分的带展宽受纵向，径向，固定相中的扩散的影响。这可以用Golay方程[16]来表征，理论塔板高度H为： (2-8) Dm和Ds是样品分子在流动相和固定相中的扩散系数(m2/s)， 是非保留流动相的线性流速(m/s)， 是特别组分的容量因子，dc是毛细管直径，df是固定相的厚度(m)。对于理想的毛细管电泳，纵向扩散为主要因子，则方程简化为： (2-9) 在小体积分离系统中，柱外带展宽占据主要作用，单个溶质带基本呈对称的浓度图，可以用高斯分布图及标准偏差σ表述，从统计学上说来，总的带展宽由注样、检测、柱接口的各自σ2的加和表示[15]，如果各个因子之间相互独立，则： (2-10) 对于一定的柱子，带宽参数σ可由长度(σx)，时间(σt)和体积(σV)表达。理论塔板高度H和带展宽σx是相关的: (2-11) 为了对总带展宽σtotal的贡献小于10％，注射和检测体积的形变应小于柱的σV/2，另外，检测时间(包括数据采集)应快于σt/2。

如果使用停流注射技术，停流时间应短于(σ2x/8)/Dm。在一定的保留时间t下，选择理论塔板数N应考虑到微管道尺寸的比较(毛细管电泳条件下)以及CE、LC分离实验条件的比较，表2.1、2.2、2.3列出了二种分离条件下各种参数的计算值。计算出微管道直径范围在2.8-24mm，微管道长度为6.5-8.1cm之间。表2.1 在给定分离效率下CE、LC的参数计算设置值 Tab. 2.1 Calculated Parameters sets for a Given Separation Performance Obtained with CE,LC 参数CELC 理论塔板数N100 000100 000 分析时间t( =5)(min)11 微管道内径dc(mm)242.8 微管道长度L(cm)6.58.1 压力降 DP(kPa)2 600 电压 DU(kV)5.8 峰容量(n)180220 *假设样品在流动相中的扩散系数为1.6´10-9m2/s (CE, LC)，流动相的粘度为10-3N×s/m2(CE,LC)；流动相的电导率0.3S/m；电渗与zeta电势的乘积5.6´10-11N/V(CE)。从表2.1可以看出，要达到100 000个理论塔板的分离效率，则分离管道的内径应降到很低，对以色谱原理进行分离的体系来说，假设分离管道长度为8 cm，则其内径大约要降低到2.8 mm才能达到要求。而对于一长度为6 cm的毛细管，内径则要降到24 mm。

管道缩微的优越性可以从表2.2、2.3可以看出，分离分析时间、响应时间、分离所需的电压、样品与试剂消耗量等大大降低了，但是对检测器的要求提高了，这就要求配备高灵敏度的检测器。因此，上述的公式以及计算的数据可以提供一个参考，即设计合理分离效率、分析时间、适合检测器响应以及具体分析体系要求的mTAS系统。表2.2 在给定分离效率下对CE、LC计算所得的信号带宽 Tab. 2.2 Calculated Signal Bandwidths for a Given Separation Performance Obtained with CE,LC 参数CELC 理论塔板数 N100 000100 000 分析时间t( =5)(min)11 信号带宽 sx(mm)0.210.56 信号带宽 st (ms)4270 信号带宽 sv (pL)943.3 sx/d~10~200 表2.3 在给定分离效率下，CE,LC对检测器要求的计算值 Tab. 2.3 Caculated Detector Requirements for a Given Separation Performance Obtained with CE,LC. 参数CELC 理论塔板数 N100 000100 000 分析时间t( =5)(min)11 检测体积 sv/2(pL)9时，玻璃管道电渗流的大小大约为9.5×10-4cm2/Vs[69]。但是大多数有机物并不包含离子化的官能团，这使聚合物有机材质微芯片上管道中的电渗流极小[69]。例如，采用X-光刻和注模法制作PMMA的微管道，其电渗流仅为1.2×10-4cm2/Vs。另外，PMMA的电渗流与pH(3～11)无关。其它一些聚合有机物如聚苯乙烯等也被发现具有一定的电渗流，这表明在激光烧蚀后，在管壁上留下了一些负离子。虽然PDMS本身的电渗流较小，但是用等离子放电氧化后，将会改变其表面性质，把OSi(CH3)2O基团氧化为OnSi(OH)4-n，在中性或碱性条件下，电渗流显著增大。

 2.2.2 微管道中压力驱动流体的分散与混合 分散和混合是优化各类流动体系的重要参数，在化学工程中，目标是在原料、能源和时间最省的条件下达到最大的反应物转化率。因此，在最低物料消耗和连续流动操作的最短周期内限制分散以达到最大产率。而在流动注射分析中，要考虑原始样品溶液流到检测器的途中稀释了多少，从样品注入到读出有多长时间。为在微刻蚀管道中定量分散，选择各种设计策略，有必要考究芯片管道分散对实际应用的影响。假设微刻蚀管道的横截面积为A，宽度为W，深度为d，如果管道为矩形，则面积为A=Wd，如果管道并不是规则的矩形，其面积将会有差异。对许多分析体系都要求定量，因此考察初始体积为V0的溶液的运动。对一定样品溶液节，假设体积为V0，将会产生一定的流速 Q，流速Q=υV0，υ是样品溶液节引入管道中的频率。实际上，流速会稍微增大，因为样品溶液节被缓冲液分隔，阻止了混合。υV0/Q代表了实际样品溶液节在微管道中占据的流体分数。考察一节溶液通过管道产生的分散，分散以溶液节的初始长度L0=V0/A来衡量。如果忽略初始分散。对一分散系数K的体系，每一个溶液节将会分散为长度 LD，可由下式评价 [68,70] (2-25) t 是运动时间，在色谱分离过程中，对于两节溶液节在一定的运动距离中以不同的运动速率分开一段距离，需要一定的运动时间，也即可以获得完全的分辨率。因此，这里把这些因素固定，且独立于L0，则有： [70] (2-26) 物理意义上讲，比率对应于一节样品溶液通过管道的溶解程度，更进一步，有必要用管道参数去表达分散程度。对许多常见几何形状，分散性由下式衡量 [68,70] (2-27) U是径向速率， f(d/W)为管道实际形状的函数，对式中的常量可以归入函数 f(d/W)。但这里把其分离出来，以便在忽略径向扩散效应的情况下，在无限长的二维管道中有一个统一的值，假设管道中流体的速度为Q/A，并且忽略运动方向上的扩散，(Pe=(Ud)/D>>1)则有： [70] (2-28) 对一个固定流速的流体节，在一定的运动时间内，对较小的d2f(d/W)，流体节分散较小。上面的推论可以容易的扩散到其他系统。例如，色谱应用，对任何几何形状的管道，目的是在一定压力降和运动时间下，分离效率的提高。这可以表达为在一定运动时间内分散长度LD对两流体塞分开距离的比值。 [70] (2-29) 因此，对于较小的d2f(d/W)值，Taylor分散系数较小。一般说来，对任一给定的管道形状和深宽比，管道横截面积越小，其样品的分散越小。如果管道深度固定，管道宽度越小，则分散越小。对于固定的横截面积的管道，分散随d/W值减小而降低。在流动体系分析中，我们要求样品的分散尽量小的同时，更要求样品和试剂能尽量的混合。在微刻蚀管道中，由于管道的微小，流体流动呈层流状态，两载流的混合主要由分子扩散控制。在微芯片上，要在尽可能短的距离把样品送到检测器，而且样品到达检测器有一定的检出信号。在这里，讨论微管道呈直管、印刻回路、3D变向等形状的径向混合。在直管中，样品塞的分散是物质通过流体元在轴向和径向无数次重置位再分布的结果，这种重置位由对流和扩散的孪生过程引起。在载流中，溶质最终的浓度是对最初均匀的圆柱形样品塞进行这两种作用的相对贡献的结果，即湍流或层流。在雷诺数低于2100时为层流。根据前述讨论，mTAS中流体在微管道中的运动是很明显的层流，而在有限长度管道中，把样品输送到检测器，要有信号，必然要使样品在这段距离中能有一定程度的混合。在直管道中，促进这种混合的因素主要是分子在径向上的扩散。假设分子扩散系数为D，在一直径200 mm的管道中，分子从管壁运动到管中心所需时间为t，则这个时间要小于样品从注入流到检测器的时间才能让检测器检测到一定的信号。当然，也可以靠增加管长(在一定面积的芯片上尽可能排布管道)或者流体流速来让流体充分混合，但是，公式2-4、2-6和表2.1、2.5、2.7都表明，这将会产生很高的反向压力。在实际应用中受到限制。在折叠管道中，径向分散则是分子扩散、紊流或者二级流共同作用的结果。和分子扩散一起，流体的二次流可强有力的促进径向传质。其强度随着流路的几何变向性的增加而增加。因此，在一定的压力下，尽可能多的管道变向有助于流体的径向混合。(表3.1的二色流体混合试验也验证了这一点)。在3D变向管道中，由于流体不仅在平面方向上变向，而且在垂直方向上也产生变向，进一步加强了流体的混合，增强了混合效率。

 2.2.3 微管道中电渗流驱动流体的分散与混合电渗流驱动流体在微管道中运动是mTAS应用较多的流体驱动方式，其驱动流体运动与压力驱动有很明显的差别。流体塞子在管道中是呈梯形的塞子状前进，与压力驱动下的抛物线型不同，这在一定程度上减少了流体的轴向分散。但是电渗流驱动流体会出现歧视效应[71,72,73]，特别是在具有多个转角的微芯片上更是如此。因为在一定电压下，在管道折叠处，通过管道内壁的离子运动距离最短，但是其电场强度却最大，这加大了其运动速度，一定时间后，处于外壁的离子将落后于内壁离子。则其落后时间： (2-30) lo和li分别为折叠管道处内壁和外壁长度，uo和ui分别为内壁和外壁离子的运动速度。因为离子的速度 (2-31) 所以 (2-32) 假如管道曲率半径为r，角度为q，则由 可得： (2-33) 进一步假设折叠处管道中心的曲率半径为rc，管道宽度为w，则由 和 可得： (2-34) 管道中心的电场强度 ，则： (2-35) 因为离子的平均运动速度 ，所以： (2-36) 则管道中一节样品塞在通过一个折叠处的分散表述为： (2-37) 因此可以看出，在微芯片上管道中，管道折叠导致的样品在轴向的分散直接与折叠的曲率角度和管道宽度相关，因此在设计电渗流驱动的微管道中，一般要求把折叠处的管道宽度尽量设计窄一些，有利于减小样品带的轴向分散。考虑电渗流下流体的混合时，离子的迁移速率为 ，在这里，我们同样来考虑简单的两载流混合模型，假设在微芯片上有一个“T”型管道，管道的两个入口分别为样品和试剂的入口，“T”型的下端为废液流出口。在芯片管道上加上一定电压进行分离，为了简化装置，一般考虑只用一个电压源，在“T”型的两个入口端一端加V1的电压，一端接地。在废液出口端电压为V2。假设交叉口的电势为Vj，三条管路的电阻分别为R1、R2、R3，则由流过支流的电流等于总电流原理及欧姆定理有： (2-38) 即 (2-39) 某一种离子在各个支路管道中的运动速率分别为： ， ， (2-40) 这几个公式表明，在此条件下，要控制样品和试剂的混合，可以通过控制外加的电压来改变离子的运动速率。如要增加样品在混合管道中的量，则可以降低试剂端的电势(假如电压是加在试剂入口端)，降低试剂的流速，在混合管道中，样品的浓度将会增加，反之，样品将会被稀释。这样的试验可以通过在两管路的微芯片上进行化学发光反应进行验证，改变电压的大小，将会看到化学发光的强度随着而改变。

 2.2.4流体的多支流混合效率假设一个简单微芯片有2个入口和一个出口，两载流在其中流动时，首先考虑流动模型，雷诺数： (2-41) 是平均速率(m/s)，d是管道直径(m)， 是流体密度(kg/m3)， 是流体粘度( ),在500 mm内径的毛细管中，流速为2 mm/s的水的Re＝1。因此流体混合的主要因素是分子扩散。一个分子通过一段距离 的平均扩散时间为： [84] (2-42) D[m2/s]为扩散系数，一个分子的扩散系数为10-10 m2/s，其穿过200 mm的距离时需要的时间为： 。因此从理论上来说，内径越小，两载流的混合越快、越强。但在实际中。检出险的限制以及系统的要求，通常管道需要更大的内径。另外，实际的样品中含有特殊物质，常会加剧微尺度中分子的混合。在这里，为便于计算，设微芯片管道的内径稍微大一些，以便大颗粒物质通过。同时，溶质被层流有效的带动。假设每一条流线被划分为n层流，将会产生n2倍更快的混合。 (2-43) d是微芯片管道直径(m)。假设在 距离内分子扩散产生了有效的均匀混合，则大量的层流状态将会使化学反应趋于完全的速度增加。然而，用于增加混合而增加的支管道部分的流体流动将会增加额外的时间，流体从一个管道进入n个相同横截面积管道将会减慢速度(增加了体积)。时间t (2-44) L是产生分流系统所必需的长度，u是层流流速(m/s)。因此，可以计算出优化的管道分流数目： (2-45) 最小混合时间 (2-46) 例如，假如一个管道系统，长度为20 mm，内径200 mm，分子扩散系数为10-9m2/s，层流流速为20 mm/s。则n=4，t=3 s为优化的时间与分流管道数目。在这种条件下，流体有2/3的时间在分流流路中流动，而只有1/3的时间是在混合。

 2.2.5 微芯片管道的设计微型全化学分析系统中的核心部件是微芯片，整个分析过程的预处理，反应，混合，检测等都是在上面进行的。因此，对芯片的合理及正确设计是极其重要的。 mTAS的芯片的设计主要要对管道布局，深宽比，达到分离所需的最少管长等进行论证。缩微过程对mTAS设备中的混合、分离和测定关键过程将产生影响。常规化学中混合由对流实现，但微结构中液流的雷诺(Reynold)系数很小使得液流很难产生湍动，扩散效应在微管道混合过程中起了很大作用。根据前述对体系缩微化的分析、理论计算和流体力学的简单讨论，在微型全化学分析系统中，管道内径、形状、布局对流体流动状态及分离效率的影响是极大的，由于微芯片的自身特性，在其上的微管道不可能一律用直管。为了利用有限的空间，对微管道形状、布局的设计是必要的。从而实现：

(1)试剂更易于与样品混合；(2)降低样品带的轴向分散；(3)降低样品带的形变。同时还要考虑缩微化带来的技术难点及实用性，总之，设计一个微型全分析系统是考虑系统各项指标的综合结果。假设Péclet数为30，则由公式2-15、2-21、2-22、2-24可推导出在电渗流驱动下和压力驱动下微芯片上微管道中的理论塔板数分别为：对电渗流 (2-47) 对压力流 (2-48) 由公式2-47和2-48可以对获得一定的分离效率所需的管道长度及微管道宽度进行优选。从压力为驱动力的角度来看，当在微芯片上存在弯曲管道时，无疑会增加阻力，这将会增大样品及试剂注入的难度，对芯片的耐压性能的要求提高了。但是，在芯片上存在弯曲管道时，将会增强径向混合速度。使液流突然转向所产生的局部扰动是破坏轴向层流的最好方法。

靠近管壁而滞后的流体元可移动至流速较高的中央流线上，中央流线附近高速前进的流体元又会重新分布到管壁附近。这种过程重复得越频繁，分散样品带中的浓度梯度就越对称。在内径均匀的直管中，管道中流体层流抛物面保持不变，因为在分析时间内的径向扩散不足以打乱样品注入时最初形成的轴向分散，故峰形是非对称的。而在弯曲管道中，流体在管道折叠处产生二级流而促进径向混合，得出的峰形更加对称、高、窄，管道变向角度越大，这种效应越明显。同时，管道越长，折叠处越多，峰越对称。因此，在压力驱动的微液流管道中，忽略高压阻力因素，管道的折叠是有利的。当以电渗流驱动流体运动时，微管道中存在转角时对分离是很不利的。但是使用直管，管道的长度受限，限制了分离效率。电泳分离时，要获得高分辨率，一般要求管道的长度要达到20 cm，这在5 cm宽的芯片上，如果没有折叠管道将是困难的。但是，大多数蜿蜒和曲折的管道的分离效率都不能达到预期的效果。这已经由前述公式2-37表明，样品区带在经过一个或两个弯曲管道处后会变形，即是熟知的几何分散，这将会急剧的降低理论塔板数，也许还会抵消加长管道的作用。电泳区带的变形，通常可归属于分子运动的距离(通常称为跑道效应)以及电场强度的差异。尽管分离装置的缩微化，但是由于管道宽度上各点并不相等，因此，上述两个因素对区带的变形都会产生贡献。对于跑道效应，在管道内壁运动的分子实际上比管道外壁运动的分子经过更短的距离。

在以电场下产生的电渗流为驱动力的分离中，该问题更为严重，因为在一定的电压下，电场强度取决于距离的长短。Molho，Griffiths，Jacobson等[72,73,74]已经对此类问题进行过研究，他们提出两种解决办法：增加曲率或降低管道的宽度，这在前述的公式中也表明了这样的效果。理论上，降低流速和增加扩散系数也是解决的办法。但是降低流速，由于轴向分散的增加，将会降低分离效率。降低粘度将会增加扩散系数，同时改变流速。这两个效应趋向相互抵消，因此还是应增加曲率和降低管道的宽度。过窄的管道又会带来一系列问题，如流体通过管道的阻力增大，检测灵敏度降低。这在一定程度上可以增加管道的深度来解决。总之，微芯片及其管道的设计是对分离效率，系统集成，检测器响应极限等因素综合考虑的结果。

 2.3结论微芯片的具体设计要结合研究对象及体系反应、检测的适用及要求，针对某一类化学反应和检测方式可以设计通用的微型全化学分析芯片。可以固定系统中某些部分，而根据需要更换另一些部分，扩展系统的功用。以上对mTAS缩微化理论的分析及芯片微管道的设计只是从较为简单的角度对mTAS的可行性和实用性进行了论证，涉及的条件也大多在理想条件下。而在实际的体系中，由于管道形状的不规则性，流体流动的复杂性及多变性，推证的结果也只能粗略的指导试验。但是，这也能为在具体设计中指明方向，至少可以为更精确的推导和试验方案的设计打下基础。