端粒酶活性检测试剂盒

端粒酶活性检测试剂盒

                                                                               规格: 20T

一、试剂组成                                                                                                             

A.   裂解液(lys)                         2×1.0 ml                

B.   TRAP混合物(TRAP-mix)     1×0.6ml

C.   酶(E)                                  1×8μl                    

D.   引物R(R-primer)                1×8μl

E.   阳性对照(control)               1×10μl

二、方法

1．取细胞10^{5 _} 10⁶(组织50mg,匀浆或液氮冷冻捣碎)，立即加裂解液100μl混匀，冰浴30min,4℃，16000g离心30min，取上清。

2．在反应管中依次加入以下组份:TRAP-mix 25μl；E 0.4μl；提取液 1μl(提取液蛋白浓度0.5~0.8μg/μl)；混匀，30℃保温30min。

3． 在反应管中加入R-primer 0.4μl,混匀，加20μl石蜡油，按以下条件进行PCR扩增：变性94℃/30s；退火55℃/30s；延伸72℃/30s；循环30 次。

三、结果分析

在反应管中加5μl 6×上样缓冲液，混匀，取30μl上样于12%聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE条件下电泳，银染，出现间隔6bp梯形条带者为阳性。

四、银染方法

1．将凝胶用5倍凝胶体积的固定液(10%乙醇和0.5%乙酸)浸没，充分振荡3分钟。

2．向固定液中加入硝酸银溶液至终浓度为0.2%，振荡染色5-10分钟。

3．将凝胶用超纯水振荡洗涤2~3次，每次30秒，倾干水份。

4．将凝胶转移到5倍凝胶体积的显色液(含3.0%氢氧化钠和0.1%甲醛)中，振荡，直至所有条带出现，一般约需3~10分钟左右。

5．将显色凝胶转至新的固定液中再固定5分钟，制备干胶或照相保存。

五、注意事项

1．操作过程中避免RNase污染，阳性对照避免反复冻融。

2．最好设置一管阴性对照。

3．用于银染的水必须是超纯的或是经过玻璃装置重蒸的双蒸水。

4．避免交叉污染。

5．-20℃，至少稳定6个月。

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