iFluor 647琥珀酰亚胺酯物：生物分子荧光标记专家

iFluor 647琥珀酰亚胺酯物：生物分子荧光标记专家

AAT Bioquest的iFluor 染料经过优化，可用于标记蛋白质，特别是抗体。这些染料明亮、耐光，对蛋白质的淬灭作用最小。它们可以被荧光仪器的主要激光线（例如350、405、488、555和633nm）很好地激发。iFluor®647系列的光谱特性与Cy5 基本相同。与Cy5®探针相比，iFluor 647试剂具有更强的荧光和更高的光稳定性。它们的荧光在pH 3至11范围内与pH无关。这些光谱特性使这种新的染料家族成为Cy5和Alexa Fluor 647的绝佳替代品（Cy5与Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor®647 SE相当稳定，与蛋白质氨基具有良好的反应性和选择性。

艾美捷iFluor 647琥珀酰亚胺酯：

货号：AAT-71560

单位大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

校正因子（260 纳米）：0.03

校正因子（280 纳米）：0.03

校正因子（656 纳米）：0.0793

消光系数（cm -1 M -1）：250000

激发（纳米）：656

发射（纳米）：670

量子产率：0.25

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

库存溶液的准备：除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在 -20 °C。避免反复冻融循环。

蛋白质库存溶液（溶液 A）：

将 100 微升的反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 pH 约 9.0 的 1 M 磷酸缓冲液）与 900 微升的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度尽可能大于 2 mg/mL）混合，得到 1 毫升蛋白质标记库存溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸缓冲液调整 pH 值至 8.0-9.0 范围内。

注意：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以对抗 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。亚硝酸钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱来去除，以获得最佳的标记结果。

注意：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，偶联效率将显著降低。为了获得最佳的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围在 2-10 mg/mL 之间。

iFluor™ 647 SE 库存溶液（溶液 B）：

向 iFluor™ 647 SE 的瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。染料库存溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存两周。避免冻融循环。

样品实验协议：

这个标记协议是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor™ 647 SE 的偶联而开发的。您可能需要根据您的特定蛋白质进行进一步优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而染料/蛋白质比例过低的蛋白质偶联物则灵敏度降低。

进行偶联反应：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将 5 微升的染料库存溶液（溶液 B，假设染料库存溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质分子量约为 200KD，蛋白质的浓度约为 0.05 mM。

注意：我们建议使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定 5:1、15:1 和 20:1 的最佳染料/蛋白质比例。

继续在室温下旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。

根据制造商的说明准备 Sephadex G-25 柱。

将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂表面时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。

注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。

注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质偶联物

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的蛋白质也倾向于降低荧光。对于大多数抗体，推荐的最优 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效标记，应控制取代度，使每摩尔抗体有 4-6 摩尔的 iFluor™ 647 SE。以下步骤用于确定 iFluor™ 647 SE 标记蛋白质的 DOS。

测量吸收：

为了测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在 1-10 µM 范围内，具体取决于染料的消光系数。

读取 OD（吸光度）在 280 纳米和染料最大吸收（λmax = 656 纳米，对于 iFluor™ 647 染料）

对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范围内。280 纳米的 O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而 656 纳米是 iFluor™ 647 SE 的最大吸收。为了获得准确的 DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（红色）染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。

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地高辛-11-dUTP：作为荧光标记物在生物医学研究中的重要性

AAT Bioquest的地高辛-11-dUTP可以酶法掺入DNA/cDNA中，作为其天然对应物dTTP的替代品。随后使用与辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）或荧光染料偶联的地高辛抗体检测所得地高辛标记的DNA/cDNA探针。11原子接头连接到尿苷的C5位，以尽量减少DIG对PCR聚合酶掺入底物的干扰。PCR和Nick翻译的典型比例为1:2地高辛-11-dUTP/dTP。

TE缓冲液中地高辛-11-dUTP*1 mM溶液的化学结构

艾美捷地高辛-11-dUTP：

货号：AAT-17012

单位大小：25 纳摩尔

目录编号：17012

分子量：1132.87

溶剂：水

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

地高辛-11-dUTP文献参考：

A visual DNA chip for simultaneous detection of hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus type-1

Authors: Wen JK, Zhang XE, Cheng Z, Liu H, Zhou YF, Zhang ZP, Yang JH, Deng JY.

Journal: Biosens Bioelectron (2004): 685

Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling

Authors: Cox WG, Singer VL.

Journal: Biotechniques (2004): 114

Aminomodified nucleobases: functionalized nucleoside triphosphates applicable for SELEX

Authors: Schoetzau T, Langner J, Moyroud E, Roehl I, Vonhoff S, Klussmann S.

Journal: Bioconjug Chem (2003): 919

Topology of yeast RNA polymerase II subunits in transcription elongation complexes studied by photoaffinity cross-linking

Authors: Wooddell CI, Burgess RR.

Journal: Biochemistry (2000): 13405

Simple method for preparation of fluor/hapten-labeled dUTP

Authors: Nimmakayalu M, Henegariu O, Ward DC, Bray-Ward P.

Journal: Biotechniques (2000): 518

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超级纯钙黄绿素,AM：细胞活性检测的荧光探针

钙黄绿素是一种亮绿色的荧光团，在结合细胞内游离钙离子时具有增强的荧光。相比之下，其AM酯衍生物没有荧光，带中性电荷。这两个特性对于钙黄绿素AM作为活细胞的特异性染色至关重要。首先，中性电荷增加了疏水性，使钙黄绿素AM能够穿过活细胞的膜。其次，AM酯掩盖了钙螯合位点，这是荧光所必需的。只有在具有活性细胞内酯酶的活细胞中，AM酯基才会被切割，钙才能结合并发出荧光。此外，转化为亲水性钙黄绿素分子会将其捕获在细胞内，而死细胞则不会保留染料。通过这种方式，钙黄绿素AM专门选择活细胞。

艾美捷超级纯钙黄绿素,AM：

货号：AAT-22003

等级：超纯

分子量：994.86

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

消光系数（cm -1 M -1）：81000

激发（纳米）：501

发射（纳米）：521

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

激发：488 纳米激光

发射：530, 30 纳米滤光片

仪器规格(S)：FITC通道

激发：490

发射：525

截止：515

推荐板：黑色壁，透明底

仪器规格(S)：底部读取模式

有关超级纯钙黄绿素,AM的FAQ：

荧光素AM在细胞中能持续多久？

被水解的荧光素AM（例如，荧光素）是一种水溶性化合物，可以保留在具有完整细胞膜的活细胞中数小时至数天，具体取决于细胞类型、细胞形态或实验条件。在 Miles 等人于 2016 年进行的基于细胞的实验中，装载了荧光素AM的前列腺癌细胞在 0.5、2、6、12、24 和 36 小时标记处被成像。在 36 小时标记处，细胞仍然适度荧光；然而，背景荧光有所增加。噪声增加的一个原因是有机阴离子转运蛋白（OATs）排出荧光素，它们在调节阴离子平衡中起着关键作用。Probenecid，作为一种 OAT 抑制剂，可以添加到荧光素AM工作溶液中，以改善去酯化荧光素的细胞内保留并减少干扰。

图：用 Calcein UltraGreen™ AM（货号 21905）染色的 HeLa 细胞的荧光图像，在 Costar 黑色壁/透明底 96 孔板中。洗涤后，添加回生长介质，并使用配备 FITC 滤光片的显微镜监测细胞长达 24 小时。

荧光素AM可以固定吗？

简单地说，不，荧光素AM是不可固定的。无论使用哪种固定方法 - 醛类或甲醇固定 - 用荧光素AM染色的细胞都会失去它们的染色模式。此外，荧光素AM不能用于固定细胞，因为它们缺乏将荧光素AM转化为荧光素所需的酯酶以及保留染料所需的膜完整性。荧光素AM是一种荧光原酯酶底物，只能用于活细胞以确定细胞活性。

荧光素AM能染色细菌吗？

荧光素AM染色不仅非常适合真核样本，还可用于确定细菌样本的细胞活性。荧光素AM适合检测许多活的革兰氏阴性细菌菌株，可用于微生物学研究、环境监测、药品无菌性测试和食品及植物评估技术。与真核细胞一样，细菌在其细胞质中含有微生物酯酶，可以裂解荧光素AM的疏水阻断基团，并将它们转化为荧光荧光素。信号可以使用荧光仪器测量，其强度与存在的活细菌数量成正比。

如何制作荧光素溶液？

荧光素及其衍生物荧光素AM通常作为冻干固体供应，必须在加载到细胞中之前在溶液中重悬，通常是 DMSO。要制作荧光素或荧光素AM的库存溶液，请在高质量的无水 DMSO 中重悬染料，使浓度大约为 1 mg/mL。例如，向 50 µg 的荧光素AM中加入 50 µL 的 DMSO 将产生 1 mg/mL 的库存溶液。

对于荧光素AM，需要将库存溶液进一步稀释到水性缓冲液（例如，HBSS）中，然后才能加载到细胞中。作为水性溶液，荧光素AM容易水解，应在一天内使用。

超级纯钙黄绿素,AM文献参考：

Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates esophageal squamous cancer development

Authors: Li, Deng and Xiang, Xiaocong and Yang, Fei and Xiao, Dongqin and Liu, Kang and Chen, Zhu and Zhang, Ruolan and Feng, Gang

Journal: Biochemical and Biophysical Research Communications (2017)

Localized functional chemical stimulation of TE 671 cells cultured on nanoporous membrane by calcein and acetylcholine

Authors: Zibek S, Stett A, Koltay P, Hu M, Zengerle R, Nisch W, Stelzle M.

Journal: Biophys J. (2006)

A vaccination and challenge model using calcein marked fish

Authors: Klesius PH, Evans JJ, Shoemaker CA, Pasnik DJ.

Journal: Fish Shellfish Immunol (2006): 20

Novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and aging

Authors: Bratosin D, Mitrofan L, Palii C, Estaquier J, Montreuil J.

Journal: Cytometry A (2005): 78

Cytotoxic effects of 100 reference compounds on Hep G2 and HeLa cells and of 60 compounds on ECC-1 and CHO cells. I mechanistic assays on ROS, glutathione depletion and calcein uptake

Authors: Schoonen WG, Westerink WM, de Roos JA, Debiton E.

Journal: Toxicol In Vitro (2005): 505

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Helixyte绿色荧光dsDNA定量试剂盒，表现出显著的荧光增强

Helixyte™Green dsDNA定量检测试剂盒可用于在ssDNA、RNA和游离核苷酸存在的情况下选择性检测低至25 pg/ml的dsDNA。Helixyte™Green在与dsDNA结合后表现出显著的荧光增强。该检测方法在三个数量级上呈线性，序列依赖性很小，使您能够准确测量来自许多来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、迷你制备DNA或PCR扩增产物。Helixyte™Green dsDNA定量分析试剂盒的灵敏度比紫外吸光度读数高几个数量级。它在等摩尔量的RNA存在下对dsDNA具有特异性。该试剂盒具有强大的混合读取格式，与96孔和384孔荧光微孔板阅读器兼容。它也可以与台式荧光计或手持式荧光计（如Qubit荧光计）一起使用。

艾美捷Helixyte绿色荧光dsDNA定量试剂盒：

货号：AAT-17650

单位大小：200 测试

目录编号：17650

激发（纳米）：

502

发射（纳米）：

522

H-短语：H303, H313, H340

危险符号：T

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R68

UNSPSC：41116134

激发：490 纳米

发射：525 纳米

截止：515 纳米

推荐板：实心黑色

组分：

组分 A：Helixyte Green™    1 瓶（100 µL，DMSO 中 200X）

组分 B：测定缓冲液    1 瓶（50 mL）

组分 C：牛胸腺DNA标准   1 瓶（200 µL，100 µg/mL）

协议概要：

加入 100 µL dsDNA 标准品或测试样本

加入 100 µL Helixyte Green™ 工作溶液

在室温下孵化 5-10 分钟

在 Ex/Em=490/525 纳米监测荧光

重要说明：

以下是一个使用 Helixyte Green™ 量化 dsDNA 的示例协议。在打开之前，请让所有组分升至室温。目前没有数据涉及 Helixyte Green™dsDNA 染色剂的致突变性或毒性。由于这种试剂与核酸结合，应将其视为潜在的致突变物，并进行适当处理。DMSO 库存溶液应特别小心处理，因为 DMSO 已知能促进有机分子进入组织。

dsDNA 标准：

将 2 µL 的 100 µg/mL dsDNA 库存溶液（组分 C）加入到 198 µL 的测定缓冲液（组分 B）中，以获得 1 µg/mL dsDNA 溶液，然后进行 1:2 连续稀释以获得连续稀释的 dsDNA 标准（DS7 - DS1）。

工作溶液的准备：

通过将 50 µL 的 Helixyte Green™（组分 A）加入到 10 mL 的测定缓冲液（组分 B）中来准备 Helixyte Green™ 工作溶液。用箔纸覆盖或将其置于暗处以保护工作溶液不受光线影响。注意：建议在塑料容器而不是玻璃容器中准备此溶液，因为染料可能会吸附到玻璃表面。为了获得最佳结果，应在制备后几小时内使用此溶液。

图：使用Helixyte Green™（蓝色）和Invitrogen™Quant-iT™PicoGreen®dsDNA试剂（红色）比较dsDNA剂量反应。dsNDA标准品在试管中孵育，并使用varian cary eclipse荧光分光光度计进行测量。

Helixyte绿色荧光dsDNA定量试剂盒文献参考：

Inhibitors of Streptococcus pneumoniae surface endonuclease EndA discovered by high-throughput screening using a PicoGreen fluorescence assay

Authors: Peterson EJ, Kireev D, Moon AF, Midon M, Janzen WP, Pingoud A, Pedersen LC, Singleton SF.

Journal: J Biomol Screen (2013): 247

Validation of a PicoGreen-based DNA quantification integrated in an RNA extraction method for two-dimensional and three-dimensional cell cultures

Authors: Chen Y, Sonnaert M, Roberts SJ, Luyten FP, Schrooten J.

Journal: Tissue Eng Part C Methods (2012): 444

Characterization of PicoGreen interaction with dsDNA and the origin of its fluorescence enhancement upon binding

Authors: Dragan AI, Casas-Finet JR, Bishop ES, Strouse RJ, Schenerman MA, Geddes CD.

Journal: Biophys J (2010): 3010

Comparison of SYBR Green I-, PicoGreen-, and [3H]-hypoxanthine-based assays for in vitro antimalarial screening of plants from Nigerian ethnomedicine

Authors: Abiodun OO, Gbotosho GO, Ajaiyeoba EO, Happi CT, Hofer S, Wittlin S, Sowunmi A, Brun R, Oduola AM.

Journal: Parasitol Res (2010): 933

Metal-enhanced PicoGreen fluorescence: application to fast and ultra-sensitive pg/ml DNA quantitation

Authors: Dragan AI, Bishop ES, Casas-Finet JR, Strouse RJ, Schenerman MA, Geddes CD.

Journal: J Immunol Methods (2010): 95

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iFluor488-dUTP：更亮的信号，更强的光稳定性

染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸盐是通过常规酶掺入方法（如逆转录、缺口翻译、随机引物标记或PCR）生产染料标记DNA的最常见方法之一。这种酶荧光标记方法广泛用于FISH探针和基于微阵列的实验。这种iFluor 488 dUTP缀合物使用SpectrumGreen™滤光片组作为绿色荧光色（SpectrumGreen®是Vysis的商标）。与常用的绿色探针（如荧光素-12-dUTP）相比，iFluor 488提供了更亮的信号，具有更强的光稳定性，不受pH值的影响。

艾美捷iFluor488-dUTP：

货号：AAT-17044

单位大小：25 纳摩尔

分子量：1152.83

溶剂：水

校正因子（260 纳米）：0.21

校正因子（280 纳米）：0.11

消光系数（cm -1 M -1）：75000

激发（纳米）：491

发射（纳米）：516

量子产率：0.9

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

图：荧光素和iFluor®488 dUTP标记的端粒探针在中期HeLa细胞中的荧光原位杂交。

iFluor488-dUTP文献参考：

Anti-proliferative effect of Fe(III) complexed with 1-(2-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)-4-aminosalicylhydrazone in HepG2 cells.

Authors: Fukushima, Takeshi and Taniguchi, Erina and Yamada, Hiroshi and Kato, Kiyomasa and Shimizu, Ayako and Nishiguchi, Yoshikazu and Onozato, Mayu and Ichiba, Hideaki and Azuma, Yutaro

Journal: Biometals : an international journal on the role of metal ions in biology, biochemistry, and medicine (2015): 669-77

Localisation of abundant and organ-specific genes expressed in Rosa hybrida leaves and flower buds by direct in situ RT-PCR.

Authors: Jedrzejuk, Agata and Mibus, Heiko and Serek, Margrethe

Journal: TheScientificWorldJournal (2012): 609597

SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection.

Authors: Rockenbauer, Eszter and Petersen, Kenneth and Vogel, Ulla and Bolund, Lars and Kølvraa, Steen and Nielsen, Kirsten Vang and Nexø, Bjørn A

Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2005): 80-6

[Comparative genomic hybridization analysis of nasopharyngeal carcinoma drug-resistant cell CNE2/DDP and its parent cell CNE2].

Authors: Jiang, Run-De and Hu, Liang and Guan, Xin-Yuan and Zhang, Li-Xin and Yue, Wen and Cen, Xin-Tang and Li, Chun-Hai

Journal: Ai zheng = Aizheng = Chinese journal of cancer (2004): 386-90

Flow cytometric detection of beta-D-glucuronidase gene in wild-type bacterial cells using in-situ PCR.

Authors: Sachidanandham, Ramaiah and Gin, Karina Yew-Hoong

Journal: Biotechnology and bioengineering (2003): 127-33

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iFluor 555-麦胚凝集素(WGA)结合物：精准的细胞标记和成像解决方案

小麦胚芽凝集素（WGA）是一种凝集素，能够与N-乙酰-D-葡萄糖胺和唾液酸结合。它是研究最深入且在生物学应用中最有用的凝集素之一。由于WGA能够与糖缀合物结合，其衍生物和结合物被广泛用于标记细胞膜和纤维化瘢痕组织，以进行荧光成像和分析。WGA的糖结合特异性针对的是β-1,4-GlcNAc连接残基序列，即壳聚糖。每个单体包含两个相同且不相互作用的结合位点，这些位点与3或4个β-1,4-GlcNAc单元互补。在所检测的单糖中，只有GlcNAc能够与WGA结合。ManNAc不结合，而GalNAc结合力很弱。它展现出iFluor® 555染料的明亮红色荧光。iFluor®555 WGA结合物与唾液酸和N-乙酰葡糖胺残基的结合方式与AF555 WGA结合物相同。

艾美捷iFluor 555-麦胚凝集素(WGA)结合物：

货号：AAT-25539

单位大小：1 毫克

溶剂：水

校正因子（260 纳米）：0.23

校正因子（280 纳米）：0.14

消光系数（cm -1 M -1）：100000

激发（纳米）：557

发射（纳米）：570

量子产率：0.64

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

激发：Cy3, TRITC 滤光片组

发射：Cy3, TRITC 滤光片组

推荐板：黑色壁，透明底

储备溶液的制备：

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等分，并在制备后储存在-20°C下。避免反复冻融循环

iFluor®555小麦胚芽凝集素（WGA）结合物储备溶液（200X）

将500µL的ddH2O加入粉末中，制成2mg/mL的储备溶液。

注：复溶的结合物溶液可以在2-8°C下短期储存，也可以在-20°C下长期储存。

iFluor 555-小麦胚芽凝集素（WGA）结合物库存溶液（200X）

向粉末中加入500 µL的去离子水，制成2 mg/mL的库存溶液。

注意：重组后的结合物溶液可以储存在2-8 °C进行短期储存，或在 -20 °C进行长期储存。

工作溶液的准备：

iFluor® 555-小麦胚芽凝集素（WGA）结合物工作溶液（1X）

向1 mL HHBS缓冲液中加入5 µL的200X WGA结合物溶液。

注意：不同细胞系的最佳染色浓度可能不同。推荐的起始浓度为活细胞5-10 µg/mL。

样品实验协议：

在打开前将瓶加热至室温并短暂离心。染色协议因应用而异。应通过实验确定结合物的适当稀释度。

活细胞染色：

用HHBS缓冲液洗涤细胞两次。

加入100 µL iFluor® 555-WGA工作溶液。

在37 °C下用WGA工作溶液孵育细胞10-30分钟。

用HHBS缓冲液洗涤细胞两次。

使用Cy3/TRITC滤光片组在荧光显微镜下成像细胞。

固定细胞染色：

WGA结合物也可用于染色固定细胞。

用4%的甲醛在PBS中固定细胞。

注意：对于固定细胞膜染色，建议跳过通透化步骤进行染色。固定后的通透化步骤可以帮助染色细胞内室，如高尔基体和内质网（ER）结构。

加入100 µL iFluor® 555-WGA工作溶液。

在室温下用WGA工作溶液孵育细胞10-30分钟。

用HHBS缓冲液洗涤细胞两次。

使用Cy3/TRITC滤光片组在荧光显微镜下成像细胞。

图：活HeLa细胞用5µg/mL的iFluor®555小麦胚凝集素（WGA）偶联物染色30分钟，然后用Hoechst 33342（AAT Cat#17535）染色。使用Cy3/TRITC和DAPI滤光片组通过荧光显微镜获取图像。

iFluor 555-麦胚凝集素(WGA)结合物文献参考：

Wheat germ agglutinin is involved in the protective action of 24-epibrassinolide on the roots of wheat seedlings under drought conditions.

Authors: Avalbaev, Azamat and Bezrukova, Marina and Allagulova, Chulpan and Lubyanova, Alsu and Kudoyarova, Guzel and Fedorova, Kristina and Maslennikova, Dilara and Yuldashev, Ruslan and Shakirova, Farida

Journal: Plant physiology and biochemistry : PPB (2020): 420-427

Membrane-associated gamma-glutamyl transferase and alkaline phosphatase in the context of concanavalin A- and wheat germ agglutinin-reactive glycans mark seminal prostasome populations from normozoospermic and oligozoospermic men.

Authors: Janković, Tamara and Goč, Sanja and Mitić, Ninoslav and Danilović Luković, Jelena and Janković, Miroslava

Journal: Upsala journal of medical sciences (2020): 10-18

Succinylated Wheat Germ Agglutinin Colocalizes with the Toxoplasma gondii Cyst Wall Glycoprotein CST1.

Authors: Guevara, Rebekah B and Fox, Barbara A and Bzik, David J

Journal: mSphere (2020)

Wheat germ agglutinin is a biomarker of whole grain content in wheat flour and pasta.

Authors: Killilea, David W and McQueen, Rebecca and Abegania, Judi R

Journal: Journal of food science (2020): 808-815

Wheat germ agglutinin liposomes with surface grafted cyclodextrins as bioadhesive dual-drug delivery nanocarriers to treat oral cells.

Authors: Wijetunge, Sashini S and Wen, Jianchuan and Yeh, Chih-Ko and Sun, Yuyu

Journal: Colloids and surfaces. B, Biointerfaces (2020): 110572

https://www.amyjet.com/products/AAT-25539.shtml

iFluor 350马来酰亚胺：蛋白质和抗体标记的光稳定性荧光染料

AAT Bioquest的iFluor®染料经过优化，特别适合标记蛋白质，尤其是抗体。这些染料亮度高、光稳定性好，并且在蛋白质上几乎不发生猝灭。它们可以被荧光仪器的主要激光线很好地激发（例如，350、405、488、555和633纳米）。iFluor® 350染料的荧光激发和发射最大值分别约为345纳米和450纳米。这些光谱特性使它们成为AMCA和Alexa Fluor® 350标记染料（Alexa Fluor®是Invitrogen的商标）的极佳替代品。iFluor® 350马来酰亚胺的稳定性合理，并且对巯基具有良好的反应性和选择性。

艾美捷iFluor 350马来酰亚胺：

货号：AAT-1060

单位大小：1 毫克

分子量：355.34

溶剂：DMSO

校正因子（260 纳米）：0.83

校正因子（280 纳米）：0.23

消光系数（cm -1 M -1）：200001

激发（纳米）：345

发射（纳米）：450

量子产率：0.951

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

库存溶液的准备：

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在 -20 °C。避免反复冻融循环。

iFluor™ 350 马来酰亚胺库存溶液（溶液 B）：

向iFluor™ 350 马来酰亚胺的瓶中加入无水DMSO，制成10 mM的库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。延长染料库存溶液的储存可能会降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存长达4周。避免冻融循环。

蛋白质库存溶液（溶液 A）：

将100 µL的反应缓冲液（例如，pH约6.0的100 mM MES缓冲液）与900 µL的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度尽可能大于2 mg/mL）混合，得到1 mL的蛋白质标记库存溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液 A）的pH值应为6.5 ± 0.5。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白质稳定的抗体不会被很好地标记。

注意：如果蛋白质浓度低于2 mg/mL，偶联效率将显著降低。为了获得最佳的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围在2-10 mg/mL之间。

可选：如果您的蛋白质不含有游离的半胱氨酸，您必须用DTT或TCEP处理您的蛋白质以生成巯基。DTT或TCEP用于将二硫键转换为两个游离的巯基。如果使用DTT，您必须在将染料马来酰亚胺偶联到您的蛋白质之前，通过透析或凝胶过滤去除游离的DTT。以下是生成游离巯基的示例协议：

用蒸馏水准备新鲜的1 M DTT溶液（15.4 mg/100 µL）。

在20 mM DTT中制备IgG溶液：每毫升IgG溶液中加入20 µL的DTT库存，同时混合。在室温下静置30分钟，无需额外混合（以最小化半胱氨酸重新氧化为胱氨酸）。

将还原的IgG通过预平衡的“交换缓冲液”的过滤柱。收集柱上的0.25 mL分数。

测定蛋白质浓度，并汇集含有大部分IgG的分数。这可以通过分光光度法或比色法完成。

在此步骤后尽快进行偶联（见样品实验协议）。

注意：IgG溶液应大于4 mg/mL以获得最佳结果。如果抗体浓度低于2 mg/mL，则应浓缩抗体。在缓冲液交换柱上损失额外的10%。

注意：还原可以在几乎任何pH 7-7.5的缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。

注意：步骤3和4可以被透析替代。

样品实验协议：

这个标记协议是为山羊抗小鼠IgG与iFluor™ 350 马来酰亚胺的偶联而开发的。您可能需要针对您的特定蛋白质进行进一步优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而染料/蛋白质比例过低的蛋白质偶联物则灵敏度降低。

运行偶联反应：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将5 µL的染料库存溶液（溶液B，假设染料库存溶液为10 mM）加入到蛋白质溶液（95 µL的溶液A）的瓶中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质分子量约为200KD，蛋白质的浓度约为0.05 mM。

注意：我们建议使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白质比例。

继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。

根据制造商的说明准备Sephadex G-25柱。

将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂表面时，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。

注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。

注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质偶联物：

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS的蛋白质也倾向于降低荧光。对于大多数抗体，推荐的最优DOS在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效标记，应控制取代度，使每摩尔抗体有5-8摩尔的iFluor™ 350 马来酰亚胺。以下步骤用于确定iFluor™ 350 马来酰亚胺标记蛋白质的DOS。

测量吸收：

为了测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在1-10 µM范围内，具体取决于染料的消光系数。

读取OD（吸光度）在280纳米和染料最大吸收（λmax = 345纳米，对于iFluor™ 350染料）

对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便OD值在0.1到0.9的范围内。280纳米的O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而345纳米是iFluor™ 350 马来酰亚胺的最大吸收。为了获得准确的DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor 350山羊抗小鼠IgG（H+L）染色。

https://www.amyjet.com/products/AAT-1060.shtml

FluoroQuest抗淬灭试剂盒II,适合微孔板成像，科研级高效荧光保护

当暴露于激发光时，染料的荧光强度会因其光氧化或其他光反应而降低。很少有荧光染料能完全抵抗光漂白。通常，当一个部分在强激发光下反复扫描时，染料可能会在视觉评估或摄影完成之前失去明显的荧光信号。例如，荧光素（如FITC标记的抗体）的光漂白已成为荧光显微镜的一个主要问题。在严重的情况下（如藻胆蛋白标记的生物偶联物），由于极高的光漂白率，甚至无法拍摄高分辨率的荧光图像。Fluoroquest™防褪色试剂盒旨在降低染料的光漂白速率，为研究人员提供更长的观察时间。该套件包含所有可以轻松应用于成像实验的基本组件。它们都是预先混合好的即用型溶液。此套件专为微孔板格式设计，而#20001专为载玻片格式设计。

艾美捷FluoroQuest抗淬灭试剂盒II,适合微孔板成像：

货号：AAT-20003

单位大小：1 套件

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

激发：变化

发射：变化

推荐板：黑色壁，透明底

组分：

组分 A：抗褪色试剂   1 瓶

组分 B：测定缓冲液（4 °C）   1 瓶（10 mL）

协议概要：

准备样品（微孔板孔）

从板中移除液体

每个孔加入100 µL/孔的抗褪色溶液

在显微镜下检查样本

库存溶液的准备：

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在 -20 °C。避免反复冻融循环。

1. 抗褪色库存溶液：

将整个瓶的测定缓冲液（组分 B）加入到抗褪色试剂（组分 A）的瓶中。注意：当溶液变棕色时仍然可以使用，但当溶液变黑时请丢弃。

样品实验协议：

从您的96孔板中移除多余的液体。

在每个选定的孔中加入100 µL的抗褪色溶液。

样品可以在应用抗褪色溶液后立即成像。图1显示了一个典型的图像。

为了使样品的寿命最优化，请将板储存在4°C的暗处。

图：U2OS细胞装载1µM钙黄绿素AM 1小时，在96孔Costar黑板上用2%甲醛固定30分钟。去除所有培养基后，向样品中加入抗褪色试剂（100µL/孔）。使用奥林巴斯荧光显微镜在0和30秒曝光时间比较FITC信号。所有图像都使用了相同的曝光设置。

FluoroQuest抗淬灭试剂盒II,适合微孔板成像文献参考：

On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent

Authors: Cordes T, Vogelsang J, Tinnefeld P.

Journal: J Am Chem Soc (2009): 5018

Relationship between DAPI-fluorescence fading and nuclear DNA content: An alternative method to DNA quantification

Authors: Gallardo-Escarate C, Alvarez-Borrego J, Von Br and E, Dupre E, Del Rio-Portilla MA.

Journal: Biol Res (2007): 29

Strategies to improve photostabilities in ultrasensitive fluorescence spectroscopy

Authors: Widengren J, Chmyrov A, Eggeling C, Lofdahl PA, Seidel CA.

Journal: J Phys Chem A (2007): 429

The reliability of long-term storage of direct immunofluorescent staining slides at room temperature

Authors: Dikicioglu E, Meteoglu I, Okyay P, Culhaci N, Kacar F.

Journal: J Cutan Pathol (2003): 430

Comparative genomic hybridization technique

Authors: El-Rifai WE, Knuutila S.

Journal: Methods Mol Med (2001): 25

https://www.amyjet.com/products/AAT-20003.shtml