细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞因子是可溶性小分子蛋白或者多肽，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

胞内流式细胞术的发展是基于Jung与Picker采用monensin，PMA，BFA和Monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法刺激T细胞活化，阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强的细胞因子信号可被流式细胞仪检测。同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。该方法具有其它方法难以比拟的优点：

1．     快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；

2．     简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；

3．     灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；

4．     高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

5．     安全：减少样本处理与生物源性污染；

6．     接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

一、常用的标本类型和处理方法

全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×10⁶细胞/ml。

细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×10⁶细胞/mL于新鲜培养基中。

冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

二、所需试剂

1．荧光标记的细胞表面分子及胞内因子的单抗试剂（eBioscience公司提供品种丰富的不同荧光标记的抗体，详细抗体信息可登陆eBioscience的网站www.ebioscience.com查询，或直接在欣博盛公司的网站上搜索。）

2．溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（eBioscience，目录号00-4333-57）溶解红细胞。

3．激活剂

(1)佛波脂Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（BIOMOL，目录号BML-PE160）

用DMSO配制，调节浓度至0.1mg/mL，分装20μL/管，-20℃储存。勿反复冻融；每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液，PMA使用终浓度为25ng/mL细胞悬液。

(2) Ionomycin （Alexis，目录号ALX-450-006）

于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL，-20℃储存。每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，Ionomycin终浓度为1μg/mL细胞悬液。

(3)Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma，目录号 S-4881)

用无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL，4℃储存；SEB终浓度10μg/mL细胞悬液。

(4)CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。

(5)CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。

4．阻断剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内。

(1)Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506-51）

于DMSO中调节浓度5mg/mL，分装20μL/管，-20℃储存。勿反复冻融。每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，激活最后4－5小时BFA终浓度为10μg/mL细胞悬液。

注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降

(2) Monensin （eBioscience，目录号00-4505-51）

5．不含谷氨酰胺的RPMI-1640

6．固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。（eBioscience，目录号00-8222-49，含4%的多聚甲醛的PBS溶液）

7．破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333-56），

将细胞膜穿孔，利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。

8．其他试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

三、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1．收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时。

2．   阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色

(1)在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/10⁶细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

(2)对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断。

3．细胞表面染色

(1)加适当的细胞表面染色试剂20μL于Falcon管中，加入100μL激活后的全血 (细胞浓度维持在2×10⁶/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；

(2)加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

(3)离心500g 5分钟，弃上清。

4．固定和破膜

(1)加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

(2)加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

(3)加2~3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5．细胞内染色

(1)加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

(2)加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500μL PBS上机或加入500μL 1% PFA固定后再上机。

四、注意事项

1．标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2．刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。

3．选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

(1)未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。

(2)激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

(3)同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

4．Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience，目录号14-0161），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。