[干冰]PA770-PROTAC VHL/鼠源-比较多种PROTAC变体的活性

[干冰]PA770-PROTAC VHL/鼠源-比较多种PROTAC变体的活性

蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）作为一种新型治疗手段，用于靶向“不可成药”蛋白质组。

PROTACs是一种异双功能小分子，能够同时与目标蛋白和泛素（Ub）E3连接酶结合。这随后导致目标蛋白的泛素化和降解。体外泛素化试剂盒已经开发出来，用于建立一种高通量方法，通过监测蛋白质内在的泛素化能力，准确预测PROTAC的效率。我们提供针对三种E3泛素连接酶的试剂盒：Cereblon、VHL和HDM2，用于监测PROTAC介导的目标蛋白泛素化。

艾美捷[干冰]PA770-PROTAC VHL/鼠源：

货号：PA-0770-P101M  

组成：

-体外泛素化检测板：1块

-检测缓冲液（10X）：1.2mL

-E3混合液（20X）：1x250uL

-E1-E2-泛素化混合液（20X）：1x250µL

-二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶联物）：60uL（100X）

-检测试剂1（DR1）：1mL

-检测试剂2（DR2）：1mL

-封闭浓缩液（5X）：5mL

-DMSO中的PROTAC：10uL

-目标蛋白阳性对照BRD3（20X）：20uL

-抗BRD3抗体（100X）：5uL

-抗小鼠HRP偶联物（100X）：5uL

应用：

-测试PROTAC和分子胶（MGs）的活性。

-比较多种PROTAC变体的活性，并从UbMax建立预测性DC50。

-选择所有三种连接酶，用于比较PROTACs/MGs的活性，以证明选择性。

-测试PROTAC的底物特异性和亚型选择性。

https://www.amyjet.com/products/LSS-PA-0770-P101M.shtml

Suc-LLVY-AMC，蛋白酶体底物-筛选蛋白酶体和肽酶抑制剂

荧光底物，用于测定20S蛋白酶体、钙蛋白酶以及其他类胰凝乳蛋白酶的胰凝乳蛋白酶样肽酶活性（激发波长：380 nm；发射波长：460 nm）。

艾美捷Suc-LLVY-AMC，蛋白酶体底物：

货号：PS-0500-5000  

规格：5 mg  

分子量：763.9  

分子式：C₄₀H₅₃N₅O₁₀  

状态：冻干粉  

纯度：薄层色谱法检测 >98%  

溶解性：在DMSO中至少可溶至5 mM，浓度范围为10-100 µM  

储存：干粉于4°C保存；DMSO溶液于-20°C保存。避免反复冻融。  

应用：  

测定20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样肽酶活性。  

测定钙蛋白酶及其他类胰凝乳蛋白酶的肽酶活性。  

筛选蛋白酶体和肽酶抑制剂。

文献参考：

1. Tsubuki S et al. (1993) Purification and characterization of a Z-Leu-Leu-Leu-MCA degrading protease expected to regulate neurite formation: a novel catalytic activity in proteasome. Biochem. Biophys. Res.Commun. 196, 1195

2. Stein RL. et al. (1996) Kinetic characterization of the chymotryptic activity of the 20S proteasome.Biochem. 35:3899-3908

3. Dang LC. et al. (1998) Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes Biochemistry 37, 1868

4. Wang KK et al. (1996) An alpha-mercaptoacrylic acid derivative is a selective nonpeptide cell-permeable calpain inhibitor and is neuroprotective. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6687

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[干冰]SUMO E1活化酶，赋能蛋白修饰实验

SUMO（小泛素相关修饰因子）是一种类似泛素的家族成员，它调节着广泛的细胞关键事件。蛋白质的SUMO化会改变它们的细胞内定位、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用。SUMO通过一系列事件与底物结合，这些事件包括：通过E1酶（SAE1/SAE2）激活、涉及E2酶（UBC9）的结合，以及通过E2和E3蛋白连接酶的协同作用对底物进行修饰。SUMO和Nedd8通路利用单一的E1和E2，结合几种已知的E3。二聚体激活酶E1利用ATP腺苷化所有SUMO蛋白的C末端甘氨酸残基，与SAE2的半胱氨酸残基形成高能硫酯键。

艾美捷[干冰]SUMO E1活化酶：

货号：SU-0101-0025  

纯度：>80%  

分子量：39 kDa和73 kDa  

数量：25 µg  

物理状态：液体  

缓冲液：20 mM Tris，150 mM NaCl，2 mM β-巯基乙醇，10%甘油  

来源：源自大肠杆菌的重组人源酶  

标签：带有His6标签的SAE1和无标签的SAE2  

活性：体外结合使用100 nM  

储存：-80°C。避免反复冻融。

文献参考：

1. Johnson, E.S. Protein modification by SUMO. Annu. Rev. Biochem. 73, 355–382 (2004)

2. Melchior, F. SUMO–nonclassical ubiquitin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16, 591–626 (2000)

3. Boggio R et al. A mechanism for inhibiting the SUMO pathway. Mol Cell. 16(4):549-61(2004)

4. Lin, D. et al. Identification of a substrate recognition site on Ubc9. J. Biol. Chem. 277, 21740–21748 (2002)

https://www.amyjet.com/products/LSS-SU-0101-0025.shtml

[干冰]TUBE 1(FLAG标签)-从细胞和组织裂解液中捕获多泛素化蛋白

基于已知对泛素具有高亲和力的泛素结合相关结构域（UBA），串联泛素结合体（TUBEs）已被开发用于分离和鉴定泛素化蛋白。TUBEs对多泛素链的亲和力比单个泛素结合相关结构域（UBA）高出多达1000倍。此外，TUBEs已被证明能够保护多泛素化蛋白免受去泛素化以及蛋白酶体介导的降解，从而使得一些当前技术无法检测到的低丰度蛋白得以被检测。

艾美捷[干冰]TUBE 1(FLAG标签)：

货号：UM-0601-0200  

标签：FLAG

分子量：28.2 kDa

物理状态：液体

规格：200ug和1 mg

浓度：可变

储存：-80°C，避免冻融循环

应用：

-从细胞和组织裂解液中捕获多泛素化蛋白。  

-保护多泛素化蛋白免受去泛素化和蛋白酶体介导的降解。  

优势：

-亲和力比单个UBA结构域高出多达1000倍。  

-避免为捕获实验过表达带有亲和标签的泛素。  

-在没有特定针对蛋白酶体或去泛素化酶活性的抑制剂的情况下，保护多泛素链。  

-替代泛素特异性抗体用于富集多泛素化蛋白。

文献参考：

Hjerpe, R, Aillet, F, Lopitz-Otsoa, F, Lang, V, England, P, and Rodriguez, MS., Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 10,1250-1258 (2009).

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[干冰]TUBE 1(GST标签)-替代泛素特异性抗体用于富集多泛素化蛋白

[干冰]TUBE 1（GST标签）是一种基于串联泛素结合体（Tandem Ubiquitin Binding Entities，TUBEs）技术开发的高效工具，专门用于分离和鉴定泛素化蛋白。TUBEs利用已知对泛素具有高亲和力的泛素结合结构域（UBA），通过串联多个UBA结构域，显著提高了对多泛素链的亲和力，比单个UBA结构域高出多达1000倍。这种高亲和力使得TUBE 1能够高效捕获多泛素化蛋白，即使在低丰度条件下也能实现检测，弥补了现有技术的不足。

艾美捷[干冰]TUBE 1(GST标签)：

货号：UM-0101-0200  

标签：谷胱甘肽S转移酶（GST）

分子量：56 kDa

物理状态：液体

数量：200 µg和1 mg

浓度：可变

储存：-80°C，避免反复冻融。

应用：

-从细胞和组织裂解液中捕获多泛素化蛋白。  

-保护多泛素化蛋白免受去泛素化和蛋白酶体介导的降解。  

优势：

-亲和力比单个UBA结构域高出多达1000倍。  

-避免为捕获实验过表达带有亲和标签的泛素。  

-在没有特定针对蛋白酶体或去泛素化酶活性的抑制剂的情况下，保护多泛素链。  

-替代泛素特异性抗体用于富集多泛素化蛋白。

产品图片：

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[干冰]TUBE 2(HRP标签)-快速、便捷地检测多泛素链和多泛素化底物

基于已知对泛素具有亲和力的蛋白质结构域，串联泛素结合体（TUBEs）已被开发用于分离和鉴定泛素化蛋白。TUBEs对多泛素链的亲和力比单个泛素结合相关结构域（UBA）高出多达1000倍。此外，TUBEs对多泛素化蛋白具有保护作用，使其即使在低丰度条件下也能被检测到。这些特性有效地“捕获”了处于多泛素化状态的蛋白质。LifeSensors开发了HRP-TUBE 2，用于快速、便捷地检测多泛素链和多泛素化底物。

艾美捷[干冰]TUBE 2(HRP标签)：

货号：UM-0312-0050  

纯度：通过SDS-PAGE检测，纯度>95%  

分子量：38.5 kDa + HRP  

标签：辣根过氧化物酶（HRP）  

物理状态：液体  

数量：50 µg  

储存：-80°C。避免反复冻融。

应用：

通过配体印迹法检测多泛素化蛋白。  

使用各种现成的生物素支持物从细胞系、组织和器官中捕获多泛素化蛋白。  

通过组织化学法进行多泛素的原位标记检测。

[干冰]TUBE 2(HRP标签)实验结果：

连接有HRP的TUBEs能够通过远西方印迹法检测到HeLa细胞裂解液中的多泛素化链和多泛素化蛋白。将TUBE-HRP稀释至5%脱脂奶粉PBS-T溶液中的1:4000，成功检测到不同加载量（每孔500、250、10、50 ng）的-K48和-K63多泛素化链。TUBE-HRP还成功检测到来自HeLa细胞裂解液（每孔加载30 µg）的多泛素化特征。如质量控制图像所示，经过蛋白酶体抑制剂（PI）处理的细胞表现出增强的泛素化特征，这与预期一致，当使用1:4000稀释的TUBE2 HRP进行检测时。

文献参考：

Donaghy, Ryan, et al. “The BRISC deubiquitinating enzyme complex limits hematopoietic stem cell expansion by regulating JAK2 K63-ubiquitination.” Blood, vol. 133, no. 14, 2019, pp. 1560-1571.

Lv, Kaosheng, et al. “CBL family E3 ubiquitin ligases control JAK2 ubiquitination and stability in

hematopoieticstem cells and myeloid malignancies.” Genes & Development, vol. 31, 2017, pp. 1007-1031.

https://www.amyjet.com/products/LSS-UM-0312-0050.shtml

[干冰]TUBE 2(TAMRA标签)通用染色程序方案

基于已知对泛素具有亲和力的蛋白质结构域，串联泛素结合体（TUBEs）已被开发用于分离和鉴定泛素化蛋白。TUBEs对多泛素链的亲和力比单个泛素结合相关结构域（UBA）高出多达1000倍。此外，TUBEs对多泛素化蛋白具有保护作用，使其即使在低丰度条件下也能被检测到。这些特性有效地“捕获”了处于多泛素化状态的蛋白质。TAMRA-TUBE 2在TUBE 2（货号：UM202）的融合标签上连接了一个TAMRA荧光团（激发波长 = 540 nm，发射波长 = 578 nm）。由于荧光团连接在标签上，因此不会影响串联泛素结合结构域与多泛素链的结合。

艾美捷[干冰]TUBE 2(TAMRA标签)：

货号：UM-0502T-0050  

纯度：通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测，纯度>95%  

分子量：39,078 Da  

物理状态：液体，含10%甘油的PBS溶液  

数量：50 ug，浓度为X mg/mL（取决于批次号）  

溶解性：未测定  

储存：-80°C。避免反复冻融。

应用：

用于荧光显微镜的细胞/组织化学染色，检测多泛素化蛋白。  

示例图片：C2C12小鼠细胞。红色：TMR-TUBE 2；蓝色：抗泛素单克隆抗体FK2；绿色：DAPI（细胞核）。图片由V. Raz提供，荷兰莱顿大学医学中心）

通用染色程序（最佳条件需由终端用户通过实验确定）：

为了获得可检测的信号，可能需要使用蛋白酶体抑制剂（如MG-132，货号：SI9710）处理细胞，以促进泛素化蛋白的积累。  

使用甲醛（2-4%）固定细胞5-20分钟。  

用PBS洗涤。  

使用0.5% Triton处理10分钟。  

用TMR-TUBEs（推荐起始稀释度为1:500）孵育1小时。

文献参考：

Hjerpe, R, Aillet, F, Lopitz-Otsoa, F, Lang, V, England, P, and Rodriguez, MS., Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 10,1250-1258 (2009).

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磷酸帕金（pS65）兔多克隆抗体，pS65动态变化及其对线粒体自噬的影响研究

帕金蛋白（Parkin）是线粒体稳态的关键调节因子，在线粒体自噬（选择性清除受损线粒体的过程）中发挥着核心作用。帕金蛋白在丝氨酸65位点的磷酸化是一种关键的翻译后修饰，能够激活其E3泛素连接酶活性，从而促进线粒体的清除。这种抗体使研究人员能够研究帕金蛋白磷酸化的动态变化及其对线粒体自噬的影响，无论是在各种细胞环境中还是在疾病背景下。凭借其高特异性和高灵敏度，磷酸化帕金蛋白（Ser65）抗体为理解线粒体质量控制的机制提供了宝贵的见解，并可能对与线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病具有治疗意义。

艾美捷磷酸帕金（pS65）兔多克隆抗体：

货号：AB-0142-0100  

免疫原：磷酸化帕金蛋白（pS65）  

纯化：通过用合成肽（围绕帕金蛋白的pS65位点）免疫兔子产生的多克隆抗体。抗体通过亲和纯化回收，并用对照肽进行额外的免疫耗竭处理。  

特异性：该抗体仅在帕金蛋白的丝氨酸65位点磷酸化时才能检测到帕金蛋白。  

提供形式：液体，含50%甘油的磷酸盐缓冲液  

分子量：52 kDa（天然）  

数量：100 ul  

储存：-20°C保存。避免反复冻融。  

应用：Western blotting。对于所有应用，最佳条件应由终端用户确定。

磷酸帕金（pS65）兔多克隆抗体图片：

图1.  (A) Western blot分析，检测表达为His-SUMO融合蛋白的重组pS65-帕金蛋白和野生型帕金蛋白（每道200 ng），分别用LifeSensors的pS65-帕金蛋白抗体（左侧）和Cell Signaling的pS65-帕金蛋白抗体（右侧）进行检测。LifeSensors的抗体对pS65-帕金蛋白的亲和力比Cell Signaling的抗体高出9倍（化学发光定量未显示）。  

(B) 在提高对比度后，LifeSensors的抗体未能检测到野生型帕金蛋白，而Cell Signaling的抗体可以检测到，这表明LifeSensors的抗体对pS65-帕金蛋白具有更高的特异性。  

左侧：LifeSensors pS65-帕金蛋白兔多克隆抗体（0.06 ug/ml）  

右侧：Cell Signaling pS65兔单克隆抗体#36866（0.06 ug/ml，按建议稀释1:1000）

文献参考：

1. Gao, F., & Zhang, J. (2018). Mitochondrial quality control and neurodegenerative diseases. Neuronal Signaling, 2(4).

2. Kazlauskaite, A., Kondapalli, C., Gourlay, R., Campbell, D. G., Ritorto, M. S., Hofmann, K., Alessi, D. R., Knebel, A., Trost, M., &Muqit, M. M. K. (2014). Parkin is activated by pink1-dependent phosphorylation of ubiquitin at ser65. Biochemical Journal, 460(1),127–141.

3. Narendra, D. P., Jin, S. M., Tanaka, A., Suen, D.-F., Gautier, C. A., Shen, J., Cookson, M. R., & Youle, R. J. (2010). PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate parkin. PLoS Biology, 8(1).

https://www.amyjet.com/products/LSS-AB-0142-0100.shtml