反转录-聚合酶反应（RT-PCR）技术

• 实验原理

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。







• 操作步骤

1、RNA的提取：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。

2、反转录合成cDNA：
在冰上加入：


a、混匀，42℃，60min;
b、95 ℃，5min，终止反应。

3、PCR扩增：
取1支0.2ml的PCR管，在冰上加入：

1）PCR反应参数的设置：


2）PCR条件的优化：
引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。
Mg2＋浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左右。
引物和模 板的量等。

4、产物的电泳和结果的测定：
根据产物长度制作适宜
浓度的琼脂糖凝胶:


取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。


• 注意事项

所提取的RNA不能有降解，要达到最佳扩增，所需的总RNA的量是必需的。
Taq酶、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上；dNTP保存在 4度即可，勿反复冻融。
在操作过程中实验者必须戴消毒手套，并经常更换，确保无RNase的污染。
在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染：使用抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入eppendorf管内；为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。

(拜力生物化学试剂网编辑整理)