RWD-CSO1234完整的光遗传学系统Complete Optogenetics System

技术指标

总览
最初，“光遗传学”一词是指神经科学领域，它描述了使用光在整个生命头脑中成像和控制神经元功能的方法。利用光控制生物活性的概念已经存在了很长一段时间。实际上，已经预先预测了该方法在神经科学领域中作为真正的赋权工具的用途。在过去的十年中，光遗传学的巨大潜力得到了广泛的认可。神经科学中光遗传学的成就吸引了不同领域的众多研究人员和专家的兴趣，

近年来，光遗传学技术通过控制完整大脑中特定类型的细胞，对神经科学研究产生了重大影响。允许使用这些工具的一项值得注意的发展是能够在具有高时空分辨率的完整框架中控制特定细胞类型的能力。另一个可能的变革前景是将光学控制策略与不同的检测技术结合起来，以实现对生物框架的闭环控制。一些研究已经证明了神经回路的闭环控制以及细胞信号传导和基因表达程度的反馈调节控制。该研究提出，光遗传学技术将使研究人员能够揭示复杂的细胞内信号传导框架或多细胞动力学背后的潜在功能，并对其进行精确修饰以实现理想的结果。它们同样使我们能够创建和分析完整，复杂的生物过程的模型，从而开始了生物学框架中持续的“过程工程”时期。光遗传学可以允许利用通常在化学和电气过程中使用的高度发达的过程工程方法学到生物过程。

新的光遗传学设备及其应用的成功发展是一项跨学科的工作，需要针对特定??的生物学方法定制的设备。应测试在首选细胞类型中的靶向表达并获得最佳表达，并应根据要控制的空间和时间特征完善所用感光体的生物物理属性。因此，光遗传学仪器的用户需要仔细考虑生物物理质量，光遗传学工具的开发人员需要找到调整它们的方法。

细胞类型特异性是光遗传学研究的重要方面。在各种方面，对独特细胞类型进行功能测试的获得或丧失与分子生物学中的基因敲入或敲除分析相似。然而，尽管基因的含义很明确，但是细胞类型的含义却是模糊且不可预测的。这在极其复杂的框架（例如哺乳动物新皮层）中尤其有效。为了证明如此高的复杂性，已使用许多参数来描述每种细胞类型，例如发育谱系，解剖位置，基因表达，电生理以及树突和轴突形态。无论如何，单细胞分析程序的最新发展已证明基因表达模式可以代表相当数量的这些多样的细胞表型。所以，

在一组非同寻常的实验中，Liu等人证明了在啮齿类动物的特定行为任务期间增加运动的神经元可以利用c-Fos活性依赖启动子驱动的光门控离子通道Channelrhodopsin-2（ChR2）显式重新激活。 。这种重新激活仅通过光激活即可再现原始行为，显示出光学控制的记忆调用。拉米雷斯和其他人后来利用类似的方式通过光学刺激恐惧调节过程中激活的许多神经元来处理触发恐惧反应。，表明错误记忆的形成。从理论上讲，这些论证表明，光遗传学可用于重新激活特别是在行为任务过程中受到刺激的细胞群体，从而实现基于活动的靶向。鉴于可以检测多种输入信号的转录因子的不同性能，这种响应性转录可能是表达光遗传学装置来控制指导特定功能输出的细胞群体的通用方法。

在哺乳动物神经细胞中微生物视紫红质的利用是改变自然界中存在的光感受器的鼓舞性描绘，以在全新的环境中控制生理特征。为了说明起源于感光器的多种活动模式，重新利用自然界中存在的部分来管理新的生物学功能的想法已在许多应用中采用，并且随着不断发现新的感光器，估计将进一步发展。微生物视紫红质（1型视紫红质）通过信号转导来仲裁跨膜离子传输或光感测。仲裁光驱动离子迁移的微生物视紫红质已被广泛用于控制哺乳动物神经元的膜电位。它们可以分为两个机械上独特的结构：

在一些更受欢迎的微生物视紫红质中，有源自绿藻莱茵衣藻的通道视紫红质，其引导包括质子，钠，钾和钙颗粒在内的阳离子。尽管这些通道的电导率适度较低（即比高电导离子通道小100倍左右），但它们的电流能够使哺乳动物神经元在其阈值以下极化，从而开始产生动作电位。最近，通过对127种藻类的转录组进行系统的研究，发现了60多个通道视紫红质的同源物。这项检查导致了具有极快的通道动力学的高灵敏度通道视紫红质（称为Chronos）和对红色敏感的通道视紫红质（称为Chrimson）。同时，这些通道视紫红质促进了两个独特神经种群的独立多色刺激。另一项最新研究发现，阴离子在隐生植物Guillardia theta中传输光门通道，从而使啮齿动物神经元快速且可逆地光学沉默。到目前为止，微生物感觉视紫红质尚未参与光遗传学测试，这可能是由于必需跨膜或不易与其他细胞类型兼容的可溶性传感器所致。

此外，动物视紫红质是最大的GPCR家族-在人类中发现了700多种视紫红质样GPCR。鉴于对GPCR进行广泛的结构-功能关系研究，Khorana及其同事确定了牛视紫红质的胞质区可能被非光敏性GPCR的类似序列所取代，例如β2-肾上腺素能受体（β2- AR）产生嵌合的感光β2-AR。

该技术已被扩展以产生与Gq和Gs信号通路耦合的光驱动视紫红质。Gi / o耦合途径。

除了基于视紫红质的感光器外，植物和微生物中存在的光敏蛋白还参与指导包括哺乳动物细胞，酵母和细菌在内的多种细胞类型中的细胞信号传导。这种类型的光激活解笼技术已有效地应用于许多合成构建体中，例如可光激活的GTPase Rac1和Cdc42，肽结合基序和束缚的毒素。尽管事实上这种光解开技术是普遍相关的方法，但在某些情况下，为了有效控制，它需要对每个分子进行多级优化。尽管难以预期依赖构象的交换，但是可光活化结构的设计仍然提出了挑战。利用Dronpa可以解决这些挑战，它是一种光活化的荧光蛋白，看起来可以进行光学控制的模块化设计。在被光激活后，Dronpa会改变荧光，并通过展开β-折叠来单体化。该元件已被用于设计可光活化的GTP酶和蛋白酶。

存在于感光域中的另一种活动模式是诱导光的相互作用。几个LOV域，例如真菌LOV域生动（VVD）和细菌LOV域EL222，在光激活时均二聚。植物感光体，例如拟南芥UVR8在黑暗环境中以二聚体形式存在，但是在被紫外线照射后会单体化。其他光感受器域，例如拟南芥Cryptochrome-2（CRY2）和Phytochrome B（PhyB）与特定缔合体，与隐色素相互作用的基本螺旋-环-螺旋1（CIB1）和植物色素相互作用因子（PIF）异二聚。这种光激活的相互作用基本上已经被用来指导细胞内信号传导，通过选择去往或远离特定细胞内活性位置的信号蛋白，通过螯合导致信号激活或阻塞。一些实验还显示了利用光诱导的结合剂对DNA转录的光学控制，该结合剂可决定转录激活域的选择或Cre重组酶的激活。

尽管事实上自然的光感受器框架似乎依赖于光诱导的蛋白质结构域的模块性来控制各种信号传导途径，但是开发新的光遗传学装置通常需要进行有效控制的显着工程努力。一个主要的障碍是完成光遗传学设备的充分表达。如在微生物视蛋白的情况下发现的那样，光遗传学工具的表达水平可能是成功完成控制的限制因素之一。感光域的异源表达取决于宿主细胞类型，并可能导致光遗传学装置的功能活性形式水平降低。例如，一项分析评估通道视紫红质同系物的检查发现，当它们在哺乳动物细胞系中表达时，其中不到50％显示出可辨别的离子传导，甚至更低的数量在神经元中具有功能活性。增强功能性表达的一种方法是利用靶向序列改善蛋白质向优选区室的运输。无论如何，这种方法\论都不是通用的，并且在所需的细胞类型中完成光遗传学仪器的充分表达仍然是一个挑战。另一个重要的障碍是，光遗传学设备需要多种特性才能进行优化。例如，影响其控制神经运动效率的通道视紫红质的基本特性包括离子电导，光敏性，光谱灵敏度，通道动力学，

结构指导的诱变实验已导致增强的通道视紫红质，具有快速的动力学，改进的光电流，红移光谱灵敏度和改进的离子选择性。这些研究表明，可以利用诱变作用来调节重要特性，但此外，发现单个突变经常会影响多种特性。例如，ChR2中E123处的突变类似于D85（这是细菌视紫红质中的席夫碱反离子），会影响通道动力学并使运动谱发生红移。ChR2中的H134R突变可改善光电流，可能是由于膜表达增强所致。但是，会降低通道动力学。突变C128和D156显着降低了通道动力学，这有助于在更长的时间范围内保持开放通道，并成功提高了光敏度。在LOV结构域中同样发现了由单一突变引起的多特性调节的模式。例如，在Avena sativa phototropin 1 LOV2中，极度持久的残基Q513中的突变减少了暗态和光照态之间的结构修饰，并降低了暗态返回率。同样，在LOV域VVD中，M135和M165中的突变会降低恢复动力学，并提高照明状态VVD二聚体的亲和力。持久性极强的残基Q513中的突变减少了暗态和光照态之间的结构修饰，并降低了暗态返回率。同样，在LOV域VVD中，M135和M165中的突变会降低恢复动力学，并提高照明状态VVD二聚体的亲和力。持久性极强的残基Q513中的突变减少了暗态和光照态之间的结构修饰，并降低了暗态返回率。同样，在LOV域VVD中，M135和M165中的突变会降低恢复动力学，并提高照明状态VVD二聚体的亲和力。

以这种方式，光遗传学仪器的优化需要多维表征来量化每个基本参数，并且在特定情况下，可能无法独立优化单个属性。因此，感光体的适应性景观是由可能的相关因素组成的多维空间。由于用于蛋白质工程的特征筛选取决于对几个参数的快速估算，因此包括针对一个参数进行优化的定向进化技术可能会导致对设备性能所必需的其他参数进行去优化。到目前为止，一般的方法是将基于诱变的任意技术与结构指导的方法相结合，并依赖于多个突变的加和作用产生理想的构建体。此外，

光遗传学的另一个重要途径是利用各种颜色的光来控制两种自主细胞类型或程序，这些程序或程序利用具有独特光谱敏感性的感光域。已经利用微生物视蛋白对这种方法进行了详尽的研究。例如，对蓝光具有最大敏感性的ChR2已与卤代视紫红质融合，可以用黄光进行刺激以双向控制神经运动。在光谱灵敏度上有所不同的质子泵已被用于实现双色神经沉默。尽管这些实验表明可以通过利用微生物视紫红质的光谱敏感性多样性来控制神经元中的激活或降低动作电位，

实际上，在高表达水平的神经元中，红色敏感的通道视紫红质Chrimson似乎在强蓝光下激活了动作电位。然而，对Chrimson的深入生物物理表征表明，其在蓝光下的通道打开速率比在红光下的通道打开速率要慢得多，并且同样依赖于光强度。结果，通过将Chrimson与快速且光敏的通道视紫红质Chronos结合使用，并限制了蓝光的功率和持续时间，减少了蓝光下神经元的交叉激活。除非改变了生色团本身，否则可能无法完全消除微生物视紫红质的蓝光敏感性。同样，许多感光器（包括LOV域和隐色染料）对蓝光也具有最大的敏感性，与微生物视紫红质的情况一样，可能难以根除。因此，除了单独依靠光谱分离之外的技术，例如，利用蓝光下的光敏度和动力学差异，对于减少利用不同感光体进行多色控制的串扰可能很重要。

尽管事实上光遗传学中的多色控制概念可能看起来与多色荧光成像相似，但在设计使用各种光源的光遗传学研究时仍存在实际差异，需要谨慎行事。在多色荧光成像中，荧光团的交叉激活经常发生。但是，可以过滤来自多个荧光团的流出物以获取无串扰图像。在利用光诱导蛋白的研究中，任何交叉激活都可能导致无法过滤或去除的变化。

视进行生物学研究而定，例如，在强调膜电位亚阈值变化的研究中，交叉激活触发的细微变化可能会变得很重要。因此，当设计涉及各种光源的研究时，例如，利用带有钙离子报道分子的光门控离子通道，应测试用于成像的光的波长和作用力，以进行光致动器的交叉激活。值得注意的是，对蓝敏感的视紫红质似乎没有明显的红敏感度，可以在强红光下使膜电位去极化。因此，可以利用利用感光体的生物物理特性的所有特征的技术来停止交叉激活，但是可能很难完全消除引起的小串扰。

原理
通常，光遗传学装置可以由细胞类型特异性启动子或增强子驱动以完成细胞类型特异性表达。但是，遇到局限于特定细胞类型的单个遗传调控成分是很不寻常的。因此，此方法可能不合适。通常，细胞身份似乎由多种基因表达模式的组合来表征。如果存在细胞类型的特定遗传调控成分，则可以使用；它们可能没有足够高水平的光遗传学手段用于生产控制。此外，涉及复制基因的内源表达模式时，涉及完整的转录单位和所有相关的调控元件。这些成分在许多情况下可能不清楚，并且可能难以运输。

一种广泛使用的技术来完成可解决问题的细胞类型特异性表达的方法是，在转基因动物中利用病毒载体在遗传限定的细胞群体中表达重组酶。在该技术中，病毒载体（例如慢病毒或腺伴随病毒（AAV））在中等强度的启动子（例如EF-1α启动子）下支持光遗传学仪器。编码基因的光遗传学仪器首先存在于反向框架中以规避表达，并且需要重组酶运动以进行倒置和随后的表达。在遗传定义的细胞类型中确定重组酶基因的表达，对于这些细胞而言，表达水平并不重要。因此，通常使用Cre重组酶，

近来，该技术已被进一步扩展以允许靶向以众多遗传标记为特征的神经细胞类型。能够表达由自主启动子驱动的多种重组酶的转基因动物被传播这些重组酶位点混合物的病毒载体感染，导致交叉靶向。利用病毒载体还有助于其他有价值的靶向模式。一种技术涉及基于神经元的轴突投射或突触连接来靶向神经元。例如，改良的狂犬病病毒可以逆行改变神经元，而单纯疱疹病毒和水疱性口炎病毒可以顺行地通过轴突末端传播。

这些病毒可用于突触转运Cre重组酶，从而能够靶向投射到遗传定义种群的神经元。另外还揭示了AAV的特定血清型也可以仲裁有效的逆行转导。这些设备允许基于其轴突投影和可能的突触连接来瞄准光遗传学仪器。另一种靶向方法是利用神经元运动刺激的启动子和增强子表达基因。这些遗传成分与最近的早期基因不同，后者已知会在神经元运动后迅速启动表达。在某些情况下，这些元素被刺激钙依赖性激酶的钙流入激活。

对于在哺乳动物神经细胞中使用微生物视紫红质的过程，所有已知的光驱动离子泵都会通过质子的外部运动或氯化物颗粒的内部运动导致膜电位超极化。当在哺乳动物神经元中异源表达时，它们产生足够的电流以允许光学沉默。最近，描述了一种对名为Jaws的远射光高度敏感的光驱动氯化物泵，该泵促进了通过小鼠颅骨的无创神经沉默。另外刚刚发现了光驱动的向外虹吸钠（KR2），可用于神经元的光学沉默。与离子泵相反，微生物视紫红质离子通道无法按照其梯度运输离子，但是，

此外，动物视紫红质（II型视紫红质）与微生物视紫红质具有结构同源性，但仍具有G蛋白偶联受体（GPCR）的功能，在光照时可催化异三聚体G蛋白中的GDP向GTP交换。未修饰类型的视紫红质的异源表达允许光驱动刺激宿主细胞的内源性G蛋白。与使视紫红质保持整个光周期的微生物视紫红质相反，某些动物视紫红质（例如牛视紫红质）在光刺激后会失去发色团，从而需要稳定的视网膜辅因子供应。幸运的是，在哺乳动物细胞和脑组织中，可以使用足够量的视网膜辅因子来产生足够的功能性视紫红质。不过，即使在视网膜发色团稀少的细胞类型中，

此外，起源于植物和微生物的光敏蛋白通过刺激与其他蛋白结构域相连的光激活构象变化，同型/异型二聚化或多聚化而起作用。在光照时经历构象变化的一个重要例子是存在于植物，真菌和细菌生物体光感受器框架中的光氧电压（LOV）域。在这些框架中，LOV结构域可以负责通过变构偶联或空间位阻直接与其融合的效应子结构域内的运动。例如，细菌化学传感器FixL通过用其LOV域Ytva取代其Per-ARNT-Sims（PAS）基序（在结构上与LOV域同源）而被光激活。在这个模型中 LOV结构域的α-螺旋螺旋线圈接头在光照下会经历旋转运动，从而使与其融合的组氨酸激酶结构域运动。在其他模型中，LOV结构域中的构象变化导致处于点亮状态的α-螺旋展开，从而导致与其融合的效应域“解开笼罩”。