M5超强通用型基因组DNA提取试剂盒（200T）

M5 Universal DNA Mini Kit

使用说明书

产品名称            单位          货号

M5 Universal DNA Mini Kit        50T      MF033-01

M5 Universal DNA Mini Kit        100T       MF033-02

【储存条件】

室温储存12个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在37?C水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。

【产品简介】

本试剂盒利用聚合美独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

【产品特色】

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用Whatman特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好，产量高。

2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在30分钟内完成。

3. 多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量200μl全血可提取出3-6μg，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.7～1.9，长度可达30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。

【产品组份】

50T            100T                        注意事项

平衡液                       5 ml            10ml           室温密闭干燥保存

裂解液TL                   10 ml            20ml           室温密闭干燥保存

缓冲液BB                   10 ml           20ml            室温密闭干燥保存

结合液CB                   15 ml           30ml            室温密闭干燥保存

抑制物去除液IR              25 ml           50ml            室温密闭干燥保存

漂洗液WB                   15 ml           30ml           初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇

洗脱缓冲液EB               15 ml           15ml            室温密闭干燥保存

蛋白酶K溶液                 1ml            2x1ml          -20?C保存。

吸附柱AC                    50个          100个          室温密闭干燥保存

收集管（2ml）                50个          100个          室温密闭干燥保存

【注意事项】

1. 所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2. 需要自备1x PBS(磷酸盐缓冲液)和异丙醇。

3. 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。

4. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

5. 为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4?C存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。

【平衡液使用】

1. 核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

2. 使用方法：（临用前才预处理）取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

【操作步骤】

<第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!>

<使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前面“平衡液的使用”>

1.  全血样品

a. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。

如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。

如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20μl，可加缓冲液BB补足到200μl后进行后续步骤。

b. 加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70?C放置10分钟。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。

<可选：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟>。

c. 冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

<上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀>。

d. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

e. 接操作步骤项下5。

2. 组织培养细胞

a. 收集约10⁵-10⁶悬浮细胞到一个1.5ml离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

b. 13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。

c. 加200μl 1x PBS重悬洗涤细胞，13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清, 将细胞沉淀重悬于180μl 1x PBS中。

d. 加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70?C放置10分钟。

<可选：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟>。

e. 冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

f. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

g. 接操作步骤项下5。

3. 动/植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）

a. 将20-50mg新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块（切成小块可以提高产量）或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

b. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

c. 将裂解物放置在55?C水浴1-3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

<可选: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟>。

d. 加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70?C放置10分钟。

e. 冷却后加100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

f. 用1ml的枪头吸取混合物，加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

<如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱>。

g. 接操作步骤项下5。

4.  动物组织（鼠尾）

a. 将0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。

b. 加入20μl的蛋白酶K (20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

c. 将裂解物放置在55?C水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

<可选: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加20μl RNase A (25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟>。

d. 用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次。

e. 加入200μl 结合液CB和100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。

<上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀>。

f. 13,000rpm 离心5分钟，将上清加入吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

g. 接操作步骤项下5。

5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

6. 加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7. 加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70?C水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

<洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过会降低DNA洗脱效率和得率>。

10. DNA可以存放在2-8?C，如果要长时间存放，可以放置在-20?C。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。