RD-D-1312牛肺疫支原体(MB)核酸检测试剂盒(PCR法)

【产品名称】

通用名称： 牛肺疫支原体(MB)核酸检测试剂盒

Name  ： Diagnostic Kit for  Mycoplasma Bovis DNA

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测从气管分泌物拭子、肺组织等标本中分离出的牛肺疫支原体DNA，用于牛肺疫支原体的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对牛肺疫支原体特异性引物，对牛肺疫支原体DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于7次，有效期12个月。

【所需仪器】

PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等

【标本采集】

病死或扑杀牛，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；病牛灭菌棉拭子沾取气管分泌物，放入无菌试管中

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1）样本前处理

组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中

2）DNA提取

对上述处理好的标本加入等体积核酸提取液（固体标本加入50μL核酸提取液），100℃恒温处理10分钟，13,000 rpm离心5分钟，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

DNA的提取也可以采用广州维伯鑫生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

3.加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

将待检测反应管置于PCR仪反应槽内；

推荐循环参数设置：

反应体系为25μL；

5.电泳检测

1) 2%琼脂糖凝胶配制：稀释50×TAE缓冲液至1×TAE (取20mL 50×TAE缓冲液，加980mL双蒸水至1L)，称4g琼脂糖放于500mL 锥形瓶中，1×TAE 缓冲液200 mL，置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用；

2) 电泳：在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。用移液器取10μL PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后，以5V/cm 电压，电泳20-30min（每次电泳时，每隔10min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳）。电泳后，紫外灯下观察结果。

6.结果判定

阳性质控品出现125bp条带，阴性质控品不出现条带或只出现片段较小的引物二聚体条带，实验结果成立。被检样品出现125bp条带，判断为阳性，否则为阴性。

7.产品性能指标

试剂灵敏性10-3以上，特异性100%，批间批内差异≤3%。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。