风湿安泰片中马兜铃酸A的HPLC限量检查

风湿安泰片中马兜铃酸A的HPLC限量检查

丁爱英[1]    高玉秋[2]  李艳茹[1]   曲佳[1]   康樱樱[1]   陈艳秋[1] 

作者 1吉林益民堂制药有限公司    136001

     2四平巿中心医院            136000

摘要：目的  建立HPLC法测定风湿安泰片中马兜铃酸A的方法。方法：采用RP-HPLC法测定。用VertexC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,以甲醇-水-冰醋酸（59：40：1）为流动相，流速为1ml/min，检测波长250nm，柱温为室温，进样量为10μl。结果  马兜铃酸A的保留时间约为32分钟，与其他峰的分离度大于1.5。马兜铃酸A的线性范围为1.038μg/ml-127.6μg/ml，γ=0.9998，最低检测限为5.34×10-3μg（信噪比为3：1），平均回收率为98.682%(n=5)。结论  该方法简便快速，结果准确可靠，可用于风湿安泰片中马兜铃酸A的测定，马兜铃酸A未检出。

关键词：风湿安泰片；马兜铃酸A；高效液相色谱

风湿安泰片是以生川乌、生草乌、细辛等二十五味药材为原料提取制得的纯中药制剂，具有舒筋活血，祛风镇痛的作用。用于筋骨麻木，手足拘挛，腰腿疼痛，风湿性关节炎等症。细辛中含有马兜铃酸A。马兜铃酸A具有蓄积毒性，长期或大量服用或导致严重的肾毒性、肝毒性等，因此，监测马兜铃酸A对于保障风湿安泰片的用药安全性具有重要的意义。本实验是在建立风湿安泰片中马兜铃酸A鉴别的基础上，采用HPLC法测定了其限度，低于于最低检测限度，可视为未检出。

1         仪器与试药

STI500高效液相色谱仪，UV501紫外检测器，N2010色谱工作站。甲醇为一级色谱纯，其他试剂均为优级纯。风湿安泰片由吉林益民堂制药有限公司生产，马兜铃酸A（批号为110746-200305）对照品购于中国药品生物制品检定所。

2         方法和结果

2.1     色谱条件：色谱柱：STI500型液相色谱柱（VertexC18，250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇-水-冰醋酸（59：40：1）为流动相，流速为1ml/min，检测波长250nm，柱温为室温，进样量为5μl。

2.2 对照溶液的制备：取马兜铃酸A对照品6.38mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2.5ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备：取风湿安泰片20片，除去薄膜衣，研细，取约5g，精密稳定，加甲醇50ml，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.5%氢氧化钠溶液15ml溶解，用6mol/L盐酸溶液调节PH至2，滤过，滤液转移至分液漏斗中，用正已烷萃取两次（10ml 、10ml），萃取后的水溶液用三氯甲烷振荡萃取4次（10ml 、10ml、10ml 、10ml），合并萃取后的三氯甲烷溶液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 色谱系统性试验：照上述色谱条件，分别取对照品、细辛药材、供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图1-3。可见，风湿安泰片供试品色谱图中，在与马兜铃酸A对照品色谱相应的位置上，无相同保留时间的色谱峰，而细辛药材色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰。马兜铃酸A的保留时间约为32分钟，理论塔板数以马兜铃酸A峰计不低于3000，

图1  马兜铃酸A对照品
图2   细辛药材
图3  风湿安泰片
2.5 线性关系考察：取马兜铃酸A分别配成1.038μg/ml、1.110μg/ml、1.276μg/ml、1.595μg/ml、6.38μg/ml、127.6μg/ml六种不同浓度的对照溶液，按上述色谱条件依次进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=48352.05X-66881.77，相关系数为γ=0.9998.结果表明, 马兜铃酸A浓度在1.038μg/ml-127.6μg/ml与峰面积有良好的线性关系。

    2.6  最低检测限：在信噪比S/N=3时，最低检测限为5.34×10-3μg。

    2.7  重现性考察：取20061001批号样品按上述供试品溶液制备方法制备，分别取5μl，连续进样5次，结果表明，供试品溶液的色谱图上在32分钟左右没有相应的峰出现。说明风湿安泰片的马兜铃酸A未检出，重现性良好。

    2.8  精密度试验:精密吸取对照品溶液5μl,重复进样5次,测定峰面积,结果马兜铃酸A的峰面积RSD为1.79%。

    2.9  回收率试验：采取加样回收法。精密量取批号为20061001的样品5g 5份，分别加入马兜铃酸A对照溶液适量，制备供试品溶液，进样，按上述色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果马兜铃酸A的平均回收率为102.68%,RSD为1.72%。

    2.10  稳定性试验:取对照溶液,按上述色谱条件每隔2小时测定一次，记录峰面积，结果表明，马兜铃酸A在8小时内稳定，RSD为1.34%

2.11  样品测定:取风湿安泰片(批号为20061001、20061002、20061003)，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，色谱图中在32分钟左右均未有峰出现，说明风湿安泰片中未检出马兜铃酸A。

2.12  药材测定:取细辛药材按供试品溶液制备方法制备,进样5μl，记录色谱图，进行分析，细辛药材中含马兜铃酸A为22.10μg/g。经折算，马兜铃酸A按100%转移到制剂中，为2.95×10-3μg,远远低于最低检出限 5.34×10-3μg，因此判定风湿安泰片中含马兜铃酸A不得检出。

3  讨论

3.1 实验以甲醇-水为流动相, 马兜铃酸A易拖尾,于流动相中加入适量的冰醋酸可抑制。

3.2 本实验参考文献[1-3]，并结合实验，确定供试品经超声、酸化、正已烷、三氯甲烷萃取，可消除其他物质对马兜铃酸A色谱峰的干扰。

3.3  我国新药在审评过程中要求马兜铃酸不得检出，本实验确定的方法简便、快速，准确可靠，灵敏度高，可用于检测风湿安泰片中马兜铃酸A的限量，以确保该药的安全、合理使用。

参考文献：

[1]中药高效液相色谱法应用    P190

[2]中国医药报 2004-04-29 马兜铃酸检测方法概述

[3]益肾蠲痹丸是否含有马兜铃酸的实验研究  中国中医研究院基础理论研究所