高效液相色谱法测定畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量

1.实验目的

　　据标准GB/T14931.1-94测定畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量。最低检出浓度为：0.15，0.20，0.65mg/kg。

　　2.试验原理

　　样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。标准加法定量。

　　3.试剂

　　3.1乙腈(分析纯)。

　　3.20.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g(±0.01g)磷酸二氢钠(NaH2PH4.2H2O)溶于蒸馏水中，定容到100mL，经过滤器过滤（选用微孔滤膜为0.45μm），备用。

　　3.3土霉素(OTC)标准溶液：称取土霉素0.0100g(±0.0001g)，用0.1mol/L盐酸溶液每毫升含土霉素1mg。

　　3.4四环素(TC)标准溶液：称取四环素0.0100g(±0.001g)，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容10.00mL，此溶液每毫升含四环素1mg。

　　3.5金霉素(CTC)标准溶液：称取金霉素0.0100g(±0.0001g)，溶于蒸馏水并定容成10.00mL，此溶液每毫升含金霉素1mg。以上标准品均按1000单位/mg折算。3.3～3.5溶液应于4℃以下保存，可使用1周。

　　3.6混合标准溶液：取3.3、3.4标准溶液各1.00mL，取3.5标准溶液2.00mL，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临时现配。

　　3.75％高氯酸溶液。

　　4.仪器

　　4.1高效液相色谱仪(HPLC)：具紫外检测器。赛智科技(杭州)有限公司

　　4.2振荡器：天津市恒奥科技发展有限公司

　　4.3过滤器：天津市恒奥科技发展有限公司

　　4.4超声波：天津市恒奥科技发展有限公司

　　5.色谱条件

　　5.1柱：ODS-C18(5μm)6.2mm×15cm。

　　5.2检测波长：355nm。

　　5.3灵敏度：0.002AUFS。

　　5.4柱温：室温。

　　5.5流速：1.0mL/min。

　　5.6进样量：10μL。

　　5.7流动相：乙腈/0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(用30％(V/V)硝酸溶液调节pH2.5)，35：65(V/V)，使用前用超声波脱气10min。

　　6.操作方法

　　6.1样品测定：称取5.00g(±0.01g)切碎的肉样(＜5mm)，置于50mL锥形烧瓶中，加入5％高氯酸25.0mL，于振荡器上振荡提取10min，移入到离心管中，以2000r/min离心3min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，取溶液10μL进样，记录峰高，从工作曲线上查得含量。

　　6.2工作曲线：分别称取7份切碎的肉样，每份5.00g(±0.01g)，分别加入混合标准溶液0、25、50、100、150、200、250μL(含土霉素、四环素各为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg，含金霉素0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg)，按6.1方法操作，以峰高为纵坐标，以抗生素含量为横坐标，绘制工作曲线。