PCR 反应中应用 SYBR Green I 熔解曲线检测多重转基因生物方法的建立

PCR 反应中应用 SYBR Green I 熔解曲线检测多重转基因生物方法的建立

Marta Hernández, David Rodr ? guez Lázaro, Teresa Esteve,

Salomé Prat and Maria Pla

摘要

目前，全球共批准几种转基因作物商品化，并且建立了基于单重 PCR 反应的方法来鉴别这些不同的插入片段，但是该方法对于分析所有的商业化的转基因生物制品却日渐不足。因为这些方法需要大量的检测来分析样品中所有可能的转基因成分，所以对于不断增长的转基因生物，利用针对各种不同转基因成分特异性序列的探针和引物的组合进行多重 PCR 是非常必需的。本文报道了利用 DNA 结合染料 SYBR Green I 和扩增产物的熔解曲线分析对多种转基因成分进行多重实时定量 PCR 的方法，运用该方法我们得到了针对玉米的 Maximizer 176 、 Bt11 、 MON810 、 GA21 和大豆的 GTS 40-3-2 特异性扩增产物并通过其特定的 T m 值进行鉴定 。我们还将这些产物在不同的多重 PCR 反应中进行组合，并显示该方法在鉴别 GMOs 时的灵敏度可达 0.1% 。这些方法可用作筛查试验以及单重 GMO 定量的进一步优化。

前言

近几年来，大量的转基因生物（ GMO ）已经获得了美国、欧盟、加拿大、日本及其他国家的批准，其首要的发展趋势是扩大种植面积和增加转基因特性的数目 [1] 。目前基于 DNA 基础上的 GMO 检测已被广泛认可，因为 DNA 分子在食品加工过程中的一些极端条件下可保持高的稳定性 [5,6] 。通过 PCR 的 GMO 检测需要将内源性的参照基因与外源基因同时进行平行扩增，以消除反应的抑制剂和确保样品中靶基因的成功扩增。另外，在定量分析中，参照基因也可用来估计样品中靶基因的总量。已有报道表明有几种传统 PCR 体系已经用于检测插入基因的不同区域，主要包括 Syngenta Seeds 中" Maximizer " 176 转基因玉米 [7 – 9] 和 Bt11 转基因玉米 [10] ，转基因大豆 GT40-3-2 [11 – 14] 或 YieldGard [15,16] 转基因玉米和 GA21 转基因玉米 [17] ，或 Plant Genetics Systems 的 StarLink 玉米 [18] 。而且已有报道说明传统的 PCR 可适用于检测大豆 [19] 、玉米 [7] 、油菜籽 [20] 、 马铃薯和番茄 [21,22] 中种属特异性的内源性参照。

在单一 PCR 反应中同时扩增多个序列可以节省 GMO 检测的时间和人力，因为这样就可以减少要检测所有 GMO 的反应数量 [23] 。目前已有报道在单次 PCR 反应中检测五个不同的 GMO 靶序列 [24 – 26] ，这些序列可以通过琼脂糖凝胶区分开来。尽管此方法可用来做定性分析，但是其灵敏度不高，这一点可以通过使用更高灵敏度的检测技术，如 Real-time PCR 进行改善。这一技术 [27] 的灵敏度和特异性都很高，可以实现准确的定量。此外操作的简便也降低了交叉污染的几率，可以简便的得到高通量的数据结果。目前已建立了在 Real-time PCR 中通过 TaqMan 探针来对玉米 Maximizer 176 ， Bt11 和 MON810 转化事件以及大豆 GTS 40-3-2 进行检测和定量的方法 [16,17,28 – 34] 。然而还没有将这些技术用在多重 Real-time PCR 中。因为这需要用不同的荧光素来标记不同的探针，而 Real-time PCR 中荧光的发射光谱是很难实现对不同荧光探针的区分的 [35,36] 。 结合型染料，如 SYBR Green I ，与双链 DNA 有高度亲和力，一旦与双链 DNA 结合其荧光就会大大增强 [37] ，从而可以很好的对扩增产物进行连续监测，并通过温度的变化进行熔解曲线的分析。因此尽管 SYBR Green I 的特异性不高，但通过对扩增产物解链温度（ Tm ） [38] 的分析使多重反应成为可能。

本文我们报道了在多重 PCR 反应中基于 SYBR Green I 的熔解曲线对⑴转基因大豆 GTS-40-3-2 和大豆内源性对照，以及⑵转基因玉米 Maximizer 176 和 GA21 进行检测的方法。此外，我们还将此法用于三重反应中来检测转基因玉米 Maximizer 176 ， Bt11 和 MON810 。运用这种技术，可使 PCR 产物的检测和鉴定无需任何额外步骤即可完成，因此它为 GMO 检测提供了一个有效，可靠且低成本的方法。

材料与方法

植物材料：

粉状 CRM Maximizer 176 、 Bt11 、 MON810 玉米品系和 GTS 40-3-2 大豆购于 Fluka （ Buchs, Switzerland ）；叶片（ GA21, Lycopersicon esculentum var . Ailsa Craig, Solanum tuberosum var. Desiree, Arabidopsis thaliana ecotype Columbia, Brassica napus, Brassica oleracea, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Zea diploperennis, and Zea mays cultivar W64A ）来源于 IBMB-CSIC ； DNA 提取物（提自 Secale cereale, Triticum aestivum, Panicum miliaceum, Glycine max, Lens esculenta, Vicia faba, Phaseolus vulgaris, and Lupinus albus ）由" Qpcrgmofood "项目提供。

植物 DNA 的分离与定量：

基因组 DNA 用 cetyltrimethy lammonium bromide 的方法从 0.1g 植物组织中分离得到 [39] ； DNA 浓度用 Gene-Quant RNA/DNA Calculator （ Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Germany ）测得，并经琼脂糖凝胶电泳和 EB 染色与已知的 lambda phage 标准品比较而进一步确认；

PCR 反应：

引物购自 MWG-Biotech AG （ Ebensburg, Germany ）（ Table 1 ）；

反应体系：

TaqMan PCR 反应体系： 20μl （单重或双重反应）或 50μl （三重反应） PCR 混合液：

1 ×缓冲液 II （ 100mM Tris – HC l， pH 8. 3， 500mM KCl ）

1 × SYBR Green I （ 1: 10,000 ）（ Sigm a， St. Louis, MI ）

6mM MgCl 2

200μM dNTPs

1U （单重或双重反应）或 1.5U （三重反应） AmpliTaq Gold DNA polymerase

0.2U （单重或双重反应）或 0.3U （三重反应）的 AmpErase UNG 酶

DNA 模板

对于单重的扩增反应，引物的浓度均为 300nM ；对于大豆的双重反应，引物 sttmf 3a 和 sltmr 2a 的浓度为 300nM ， sltm1 和 sltm2 为 50nM; 对于 GA21 和 Bt176 的双重反应， crytm1 和 crytm2 的浓度为 300nM ， GA21 的两个引物均为 50nM; 在三重 PCR 反应中， Bt11f/r 的浓度为 50nM ， crytm1/2 为 150nM ，分别与 200nM 的 35Saf2 和 150nM 的 monhsp508r 组合。 SYBR Green I 用无菌水稀释成 10 ×储存液（ 1 : 1000 ）。

PCR 反应条件：

第一步： 50 ℃ ， 2 min ，

第二步： 95 ℃ ， 10 min ，

第三步： 95 ℃ ， 15s

60 ℃ ， 1min

50 个循环（单重或双重反应）， 40 个循环 ( 三重反应 )

反应完成后进行熔解曲线分析：

95 ℃ ， 15s ，

60 ℃ ， 20s

然后缓慢升温至 95 ℃ ，升温速率为 0.2 ℃ /s ，并且连续记录荧光信号的变化，将温度的变化与荧光信号的变化求负倒数后对温度作图，可得到产物的 Tm 值。除特别注明外，所有反应均做三个重复。

结果与讨论

PCR 体系的设计：

在 Real-time PCR 体系中有七种不同的 SYBR Green I 被用来进行 GMO 鉴别，并在单重反应中结合引物进行了一系列浓度的优化，以排除由于染料浓度过低而造成的低信号或由于浓度过高造成的信号淬灭 [40] 。这些 PCR 体系都是针对 Roundup Ready 大豆（ Monsanto ）、玉米 Maximizer 176 和 Bt11 （ Syngenta Seeds ）、 MON810 和 GA21 （ Monsanto ）、大豆 lectin （ AN:K0082 ） [28] 以及玉米 invertase （ ivrA ； AN:U16123 ） [41] 参照基因。引物对见表 1 。这些引物的选择是根据以前传统 PCR 和 TaqMan Real-time PCR 的结果而进行的，这些结果证实了转基因引物的特异性以及用 ivrA 和 leCtin 基因来做为种属特异的内源参照的适用性，因为这些基因在各品种间没有等位变异现象，并且在培育的植物中拷贝数相同。对于在已优化的 PCR 反应条件下 SYBR Green I 的特异性实验，通过 20 种不同植物中六种不同转基因品种提取基因组 DNA ，以 50ng DNA 为模板进行 Real-time PCR 反应，进一步确定这些不同种的植物都是和玉米，大豆有种属起源关联的或是经常存在于食物当中。除了相应的转基因玉米和大豆，在所检测的植物 DNA 中未见有扩增物生成，只有以 Bt176 的基因组 DNA 为模板进行 Bt11 特异性反应，结果观察到很弱的信号（ Ct 值大于 35 ，结果未显示）。这一结果表明正如先前所报道的那样，优化的单重 PCR 体系的特异性很高。

除了引物的特异性外，多重熔解曲线分析的设计要求每一个不同的 DNA 扩增产物的解链温度必须各不相同。尽管目前的程序加入了新的参数从而可以准确估计十分接近的相邻解链温度，但特定的 PCR 反应效果仍然很难准确地确定。因此，我们用 50ng 的基因组 DNA 为模板，采用 SYBR Green I 进行 Real-time PCR ，每个反应均做四次重复，检测每个扩增序列的解链温度（图 1 ），对于每个 PCR 产物计算其解链温度的 95% 置信区间。此外，我们还在 5 个数量级的 DNA 模板范围内，对于每个扩增片段的 Tm 值进行评估。所有实验所得的 Tm 值都在所设定的 95% 置信区间内。尽管普遍认为 DNA 浓度的增加会提高双链 DNA 的 Tm 值 [40] ， 但通过熔解曲线的分析，所得的 T m 并没有偏离所计算的 置信区间。
 

我们分析了 SYBR Green I 用于多重 Real-time PCR 体系中确定熔解曲线的方法，经过对每一实验所得的 T m 值的仔细分析，我们优化了两对引物进行双重反应， ⑴ 两个转基因玉米 PCR 体系： Maximizer 176 和 GA21 ； ⑵ 一个转基因大豆 (GTS-40-3-2) 和大豆特异性内源参照基因体系。这些 PCR 体系的 Tm 值分别相差 5.1 和 5.6 ℃ ，其 95% 置信区间无重叠（图 1 ）。对于每个双重 PCR 反应，在 DNA 模板量相同的情况下我们对其引物浓度进行了优化，优化条件的确定为通过熔解曲线面积的计算而能产生相同终点扩增产物的条件。如图 2 所示，所有目标 DNA 分子在双重反应中都被正确的扩增出来，且每个特异性产物的 Tm 值都很清晰的区分开来。

我们还检测了双重 PCR 反应中 Tm 值差别更小一些的引物对，结果显示对于 Tm 值相差仅 1.5 ℃ 的扩增子（ Bt11- 和 GA21- 特异性扩增子） 仍可区分开，而对于 相差 1.2 ℃ 的扩增子（如 Bt11- 和 invertase 特异性扩增子）在熔解曲线上只表现为一个峰值，因而不适合在双重反应中应用（未显示结果）。这一结果与报道的 Tm 值在相差 2 °C 时仍能在熔解曲线上清晰区分的情况完全一致 [38,40] 。根据这些结果，我们可以利用 SYBR Green I 的多重熔解曲线分析同时检测三种 PCR 产物。为了证明这一点，我们用 Maximizer 176 ， Bt11 和 MON810 特异性 PCR 体系做三重反应，其相应的扩增片段的 Tm 值分别相差 3.6 ℃ 、 7.8 ℃ 和 11.4 ℃ ， 95% 置信区间无重叠（图 1 ）。如图 2 所示，在适当引物浓度下，完全可以清晰的区分各特异性扩增片段的 Tm 值，说明这种技术也可用于三重 PCR 反应。

多重 PCR 体系 Tm 值的灵敏度

在阐明了这些方法在双重和三重反应中的适用性后，对于在不同起始模板量的情况下该方法在多重 PCR 反应中可靠性的评估就显得尤为重要。出于该目的，我们检测了两个优化的双重反应体系的灵敏度，这两个体系分别是 Maximizer 176 和 GA21 玉米，以及 GTS 40-3-2 和 non-GM 大豆，每个体系都是由比例不同的基因组 DNA 组成的。在反应中总 DNA 模板为 50ng ，每个比例组成为： Maximizer 176 和 GA21 玉米分别为 50 、 10 、 1 和 0.1% ； GTS 40-3-2 大豆为 5 、 1 、 0.5 和 0.1% 。对于大豆的双重 PCR 反应，所有重复样品中都可以检测到低至 0.1% 的 GM- 大豆，而对于 Maximizer 176 and GA21 体系，只在四个重复样品中的两个检测到 0.1% 的转基因成分，当 DNA 的量为 1% 时，所有重复样品中均可检测出阳性结果（表 2 ）。综上所述，本研究结果表明所建立的多重 Real-time PCR 对于 Maximizer 176 和 GA21 玉米或 GTS 40-3-2 大豆的检测灵敏度分别是 1 和 0.1 ，这个限度低于已建立的 GMO 规范阈值（如 Commission Regulation (EC) Nos. 49/2000 and 50/2000 [2,3] ）。因此，这些最新建立的基于熔解曲线的 Real-time PCR 体系足以用于常规 GMO 定量检测。

多重熔解曲线的 PCR 体系在食物样品中的应用

我们对所建立的多重熔解曲线的 Real-time PCR 体系在检测混杂的种子以及面粉样品中的适用性进行了分析。根据报告中所述的优化条件，从 GTS40-3-2 大豆种子和大豆粉中提取的 DNA ，成功进行 lectin 和 CTP-EPSPS 基因的检测；以及从 GMO 玉米和面粉中提取 DNA ，成功进行 Maximizer 176 、 Bt11 和 MON810 转基因成分的检测（结果未显示）。我们还用 TaqMan 探针进行了单重 PCR 反应来进一步检测 GMO 成分的存在，以确定基于熔解曲线 Real-time PCR 方法的可靠性。

结论

据我们了解，这是第一次报道用基于熔解曲线的多重 Real-time PCR 方法来检测转基因食品，这一方法对于常规转基因食品的检测是十分方便的，而且如果要进行 GMO 定量，该方法也可作为一个检测体系，来鉴定样品中 GMO 的存在，以便应用合适的定量方法。对于 Maximizer 176 和 GA21 玉米该方法的检测灵敏度为 1% ，对于 GTS 40-3-2 大豆该方法的检测灵敏度为 0.1% ，已经接近和低于 GMO 条例所规定的阈值。因此，进一步优化这些利用 SYBR Green I 的 Real-time PCR 方法适于特定 DNA 的定量。

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