淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型

淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型

【摘要】　目的　观察β淀粉样蛋白(Aβ) 脑室内注射建立阿尔茨海默病(AD) 大鼠模型及其对大鼠行为、胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性、细胞凋亡、神经生长因子(NGF) 水平等影响。方法　将Aβ1242 注射入大鼠侧脑室,于第1 周、2 周、4 周观察Morris 水迷宫逃避潜伏期、测定脑内ChAT 活性、进行原位末端标记凋亡染色及NGF 免疫组化染色。结果　Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期延长,4 周时更明显。2 周后海马、皮层ChAT 活性下降,4 周后脑内ChAT 活性广泛下降,以海马最为显著。2 周后基底前脑Meynert核区凋亡细胞较其他脑区增多,NGF 阳性细胞明显减少。结论　Aβ脑室内注射可以模拟AD 行为改变,使脑内ChAT 活性降低,基底前脑NGF 含量减少,胆碱能神经元凋亡,可以作为AD 研究模型。

【关键词】　阿尔茨海默病　β淀粉样蛋白　胆碱乙酰转移酶　神经生长因子

　【中图分类号】　R749. 1 　　　　　　　【文献标识码】　A

　　阿尔茨海默病(Alzheimer Disease , AD) 发病的中心环节是β淀粉样蛋白(β2amyloid protein ,Aβ) 在脑中的沉积[1 ] ,多种神经元尤其是胆碱能神经元原发性变性,脑内胆碱乙酰转移酶(cholineacetyl transferase ,ChAT) 活性下降,是AD 的标志性生化改变[2 ] 。AD 等神经系统变性疾病与细胞凋亡的发生密切相关[3 ] ,而神经生长因子(nerve growth factor ,NGF) 是中枢胆碱能系统重要的神经营养因子,具有明显的抗凋亡作用[4 ] 。

AD 基础研究和药物开发的最大障碍是缺乏一种与AD 病理、生化、和行为等改变相似的理想动物模型。本实验通过Aβ脑室内注射建立AD 大鼠模型,观察大鼠行为学改变、脑内各部位ChAT 活性变化、神经元凋亡情况,以及NGF 水平改变,为进一步的AD 治疗研究提供动物模型。

1 　材料与方法

111 　动物分组及Aβ脑室内注射　雄性Wistar 大鼠48 只,体重260～300 g ,随机分为4 组:对照组、Αβ注射后7 天组、14 天组、28 天组,每组12 只。大鼠麻醉后用微量注射器缓慢将药物注入右侧脑室(前囱后018 mm ,中线旁开111 mm ,深度316 mm) 。Aβ模型组注射Aβ1242 (购自美国AnaSpec 公司) ,每次7 μg ,连续3天,对照组注射生理盐水,每次7μL ,连续3 天。

112 　Morris 水迷宫试验　参照文献方法[5 ] ,记录大鼠找到平台所需逃避潜伏期。各实验组分别于最后1 次药物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 进行试验,对照组同时试验。

113 　取材　Aβ注射组分别于最后1 次药物注射后第7 天、14天、28 天宰杀取材,对照组于最后1 次药物注射后28 天取材。每组取6 只快速断头取脑,立即冻于液氮中,待测ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚甲醛溶液中固定72小时以上,进行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫组化染色。

114 　ChAT活性检测及定量分析　液氮中冻存脑组织分别取海马、基底节、额叶、顶叶皮层制备5 %(V/ W) 脑组织匀浆, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 总反应体积中,含试样液或空白对照液20μL ,1114 g/ L 乙酰辅酶A(Sigma 公司) 10μL ,70 mmol/L 胆碱(Sigma 公司) 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明(Sigma 公司) 7μL ,3 mmol/ L 氯化钠7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰辅酶A 10μL ,在液体闪烁仪上测定每分钟衰变数(cpm) 。以对照组各部位衰变数为100 % ,计算各组各部位ChAT 相对活性。

115 　TUNEL 凋亡染色及半定量分析　选取基底节、海马、额叶、顶叶同时存在矢状断面切片,按TUNEL 凋亡染色试剂盒(武汉博士德公司) 说明书操作,进行TUNEL 细胞凋亡染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一切片高倍视野(400 ×) 下每部位取4 个视野共计数100 个神经元,计算凋亡神经元阳性百分率,即神经元凋亡指数(NAI) 。

116 　NGF 免疫组化染色及图像分析　取上述石蜡切片,按NGF免疫组化试剂盒(武汉博士德公司) 说明书操作染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一染色片高倍视野(400 ×) 下取5 个视野,用美国UIC 公司Metamorph Image System V416 图像分析软件得出阳性染色细胞平均灰度值(Average gray value Average) 。

117 　统计学分析　计量资料用均数±标准差( x ±s) 表示,各组间ChAT 活性、水迷宫试验潜伏期、NGF 阳性神经元平均灰度值比较采用t 检验,神经元凋亡指数组间比较采用χ2 检验。

2 　结果

211 　Morris 水迷宫试验结果　各组逃避潜伏期分别为:对照组(1211 ±514) s ;Aβ注射后7 天组为(1411 ±519) s ,Aβ注射后14天组为(2116 ±617) s ,Aβ注射后28 天组为(4510 ±1013) s。Aβ注射后7 天潜伏期与对照组比较无变化,注射后14 天潜伏期延长( P < 0105) ,注射后28 天潜伏期明显延长( P < 0101) ,提示大鼠学习记忆功能受损。

212 　Aβ脑室注射对ChAT 活性影响　Aβ脑室内注射对脑内ChAT 活性影响见表1 。

表1 　Aβ对ChAT活性( cpm) 影响

组　　别　　额叶基底节海马顶叶

对　照　组1208. 5 ±49. 8 3662. 3 ±118. 5 2584. 0 ±98. 8 1184. 2 ±53. 2

Aβ注射后7 天1183. 8 ±26. 7 3559. 7 ±120. 3 2513. 0 ±99. 8 1139. 3 ±43. 6

Aβ注射后14 天1033. 4 ±47. 92)3507. 5 ±126. 6 2234. 2 ±84. 52) 1088. 3 ±63. 01)

AB 注射后28 天950. 1 ±67. 52)3228. 5 ±153.

02) 1833. 0 ±57. 62) 941. 8 ±42. 42)

　1) 与对照组比较, P < 0. 05 　2) 与对照组比较, P < 0. 01

　脑室内注射Aβ7 天后,各部位脑组织ChAT 活性无明显下降,

14 天后海马、额叶ChAT 活性明显下降,28 天后各脑区ChAT 活性均明显下降( P < 0101) ,以海马下降最明显,降至对照组的71 %。

213 　Aβ对脑内神经元凋亡的影响　TUNEL 凋亡染色可见细胞核呈棕黄色染色的阳性凋亡细胞,对照组及注射后7 天各脑区见个别散在凋亡细胞,Aβ注射后14 天可见少量凋亡细胞,28 天后明显增多,NAI 升高,基底前脑Meynert 核区达1917 % ,海马、额叶、顶叶分别为617 % ,512 % ,413 % ,Meynert 核区神经元凋亡明显多于海马及皮层( P < 0101) 。Meynet 核凋亡染色见图1 。

214 　Aβ对脑内NGF 表达水平的影响　NGF 免疫组化染色于海马、额叶、顶叶、基底前脑均可见胞质黄褐色深染阳性细胞,Aβ注射7 天后无明显变化,14～28 天可见基底前脑区NGF 阳性细胞明显减少,染色变浅,其他脑区NGF 表达水平无明显变化。基底前脑区NGF染色见图2 。用美国UIC 公司Metamorph Image System V416 图像分析软件得出阳性染色细胞平均灰度值(Average gray value) 。

表2 　NGF 免疫组化染色细胞平均灰度值

组　　别　　额叶基底节海马顶叶

对　照　组135. 48 ±17. 27 129. 67 ±18. 49 126. 87 ±9. 56 138. 46 ±13. 54

Aβ注射7 天后129. 32 ±14. 47 134. 57 ±10. 38 125. 48 ±8. 21 139. 76 ±9. 72

Aβ注射后14 天131. 21 ±17. 82 149. 65 ±9. 431) 129. 24 ±12. 59 128. 45 ±12. 43

Aβ注射后28 天126. 34 ±15. 97

175. 54 ± 12.

942) 116. 75 ±11. 16 128. 27 ±10. 03

　1) 与对照组比较, P < 0105 　2) 与对照组比较, P < 0101

3 　讨论

　　近十多年积累的资料表明,前脑基底核的胆碱能神经元、海马和它们之间的通路,是学习记忆功能的重要结构基础,损毁这些结构或老龄化,可引起这些区域退化,导致智力严重缺损[7 ] 。ChAT 是ACh 的生物合成酶,存在于胆碱能神经元中,是衡量胆碱能神经元功能的标志,也是AD 动物模型成功的标志性生化指标[2 ,8 ] 。迄今为止,多数AD 物模型(如老年动物代替模型、胆碱能系统损毁模型、转基因小鼠模型) 是在模仿AD 早期出现的记忆障碍或病理特征,使其应用受到局限。本实验采用大鼠急性脑室内注射Aβ1242 ,4 周内大鼠水迷宫试验表现逐渐下降,出现了AD 表现,与文献报道一致[9 ] 。脑内海马、基底节,以及额叶、顶叶新皮层ChAT 活性均明显下降,降至对照组水平70 %以下,说明Aβ脑室内注射对脑内ChAT 活性的影响是广泛和明显的。Aβ沉积是AD 发病的中心环节和病理特征,本模型全面模拟了AD 病理、行为学和生化改变,因此脑室内Aβ注射可以作为一种理想的AD 模型制作方法。ChAT 活性的下降实际上反映了胆碱能神经元功能的下降或变性,近年来越来越多的证据表明,胆碱能神经元退化的主要方式也是细胞凋亡[3 ] 。本实验发现ChAT 活性降低的同时,脑内基底节、海马等处的凋亡神经元增多,并且以胆碱能神经元聚集的基底前脑区更为明显,所以ChAT 活性的降低可能源于Aβ所致的胆碱能神经元凋亡。基底前脑胆碱能神经元发出纤维投射到海马、边缘叶及大脑皮层,这些部位靶细胞中产生的NGF 通过胆碱能神经元的轴突末梢摄取后,经轴浆逆向运至其胞体所在的神经节,是基底前脑、隔区胆碱能神经元的主要营养因子。Aβ脑室内注射后2 周开始,基底前脑神经元NGF 含量减少,4 周时最明显,推测在本模型中,由于NGF 对基底前脑中枢胆碱能神经元营养、支持作用减弱,导致神经元发生凋亡,引起AD 的一系列行为学、生化改变。如果能采用基因治疗等方法及时补充基底前脑NGF ,将有可能治疗AD 症状,延缓AD 的进展,目前基因治疗AD 是国内外研究的热点,也是我们下一步的研究方向[10 ] 。综上所述,Aβ脑室内注射造成大鼠AD 样行为学改变,脑内ChAT 活性降低,基底前脑NGF 含量减少,胆碱能神经元凋亡,可以作为AD 研究的动物模型。