数字PCR平台

在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digital PCR或dPCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而dPCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

数字PCR技术，是通过将微量样品作大倍数稀释和分液（partitioning），直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。

图片来自Life Technologies

它是一种绝对测量方法，因为在这种条件下，只有含有1个目标分子的样品才能被不断放大至几百万倍的程度，其所产生的信号（例如荧光）将会非常强，以致可通过数个数的办法进行绝对测量，其他样品即使含有会产生干扰信号的杂质分子，但是由于杂质分子不可能发生PCR扩增，因此其信号将不可能达到能影响最终检测结果的程度。

数字PCR的概念其实早在1999年就由Vogelstein和Kinzler提出，其初衷是为了能够从大量的正常细胞中检测出突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的优势。

2006年，美国Fluidigm公司开发出第一台商业化的数字PCR系统，它是基于集成流体通路（IFC）芯片。2010年，Life Technologies也推出了数字PCR产品线 – OpenArray系统。之后，QuantaLife公司开发出微滴数字PCR（ddPCR）技术，并因此获得2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，推出了QX100微滴式数字PCR系统。

Fluidigm与IFC芯片

Fluidigm公司结合微流体技术，生物技术和微电子等技术，于2006年底推出了Bio-Mark™ 高通量基因分析系统。其创新就在于集成液体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本（试剂用量更少，样品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系统由Bio-Mark™实时PCR系统（整合了高性能计算机）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和数据分析软件四部分构成。IFC微液流芯片有2种：Dynamic Array（48.48动态芯片和96.96动态芯片）和Digital Array（12.765数字芯片和48.770数字芯片），应用于不同的基因分析中：拷贝数变化分析、遗传突变检测、基因分型、基因定量、单细胞基因表达等。

数字芯片将预混液（样品与PCR试剂）分成数百个单独的PCR反应，开展数字PCR分析。整个过程分为五步：准备芯片；将每个样品预混液移液至芯片的独立入口；将芯片放入IFC Controller，利用软件界面迫使分析组分进入单独的反应板；将芯片放入BioMark系统，开展热循环和荧光检测；利用分析软件来查看和分析扩增曲线。

Fluidigm公司分子生物学主管Ramesh Ramakrishnan认为，数字PCR的流程显然比传统的qPCR更简单，但通量较低。然而，数字PCR更特异，特别是在搜索稀有突变时。拷贝数变异分析就是一个很好的例子。采用12.765数字芯片，通过数字PCR，每个反应体系用量仅6 nL，可有效分辨12 与13 倍（或更高）的差异。

Fluidigm如今正努力让微流体芯片变得更灵活，包括每个芯片的样品量和每个样品的分液数量。Ramakrishnan表示：“目前我们每块芯片上能够开展最多48个不同样品的数字PCR，且每个样品能够分成770个单独的反应仓。我们正在探索新的芯片形式，以便更改每块芯片的样品数量以及每个样品的反应仓数量。”

Life Technologies与OpenArray

Life Technologies公司也于2010年推出了基于微流体芯片和通道的数字PCR平台 – OpenArray系统。它提供的TaqMan® OpenArray® 数字PCR试剂盒可在OpenArray® 平板上运行。

OpenArray®平板上有3072个通孔，每一个都作为独立的PCR反应孔。每个通孔的直径为300 μm，深度也为300 μm。平板以48个子阵，每个64通孔的形式排列。平板表面经过专利处理的包被，是疏水的，而通孔内部是亲水且生物兼容的。处理中，通过表面张力的作用，3072个通孔中的每一个都含有33 nL液体。通过一块OpenArray平板，您可以分析最多48个样品。

平板可在现有的OpenArray® 实时定量PCR系统以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex仪器上运行。OpenArray® 实时定量PCR系统能够同时运行3块OpenArray平板，在3小时内产生多达144个数字答案。

实验流程包括五步：1）分离并纯化基因组DNA；2）计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；3）上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板；4）循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray® 实时定量PCR系统开展读取。5）快速轻松地获取和分析数据。

对于既开展数字PCR、又开展qPCR的实验室来说，QuantStudio 12K Flex系统是个最佳选择。它支持96孔板/384孔板、TaqMan® Array卡片和中等密度的OpenArray平板。它能够同时运行4块OpenArray平板，在单次运行中产生12,228个独立的PCR反应，并实时收集PCR扩增数据。

据介绍，由于OpenArray平板的开放特性，数字PCR反应重复的数量可轻松调整，以满足应用需求。它既可运行单个子阵，也可运行全部四块平板。对于低精度的应用，您可以增加样品通量，降低成本，而对于高精度应用，您又可以提高重复的数量，让平台性能最大化。这种灵活性可轻松实现，又不折损性能。

Bio-Rad与QX100

dPCR技术继续发展，形成了ddPCR技术。这就是QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，推出了QX100微滴式数字PCR系统。

与Fluidigm和Life Technologies不同，Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍，他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴，而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多，则意味着分析越准确。

QX100微滴发生器（droplet generator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

对于QX100系统，每个液滴能容纳最多5个目标，这是因为它们能分得更多；这带来了更广的动态检测范围。据介绍，QX100可处理1-100,000个拷贝的样品，而无需在运行之前进行连续稀释。

Bio-Rad公司去年底曾在《Analytical Chemistry》杂志上发表文章，证明了QX100微滴式数字PCR系统在三个方面的作用：拷贝数变异（CNV）研究、稀有等位基因检测和血浆DNA定量。

对于CNV研究，大量的微滴提供了足够的精确度，能准确测定拷贝数状态。利用QX100微滴式数字PCR系统来筛查HapMap样品的CNV，拷贝数状态可完全分辨。对于稀有等位基因的检测，将突变DNA与高度同源的野生型DNA分开，提高了灵敏度。有了QX100系统，研究人员能够检测BRAF V600E中低至0.001%的突变片段，与定量PCR相比，灵敏度提高1000倍。最后，研究人员还利用微滴式数字PCR技术准确检测了孕妇血浆中高度片段化的DNA，这有望应用于无创产前诊断。
结语

随着技术的不断发展，数字PCR正变得越来越灵活。例如，尽管大部分数字PCR流程从基因组DNA或cDNA样品开始，但一些dPCR系统也可使用RNA作为起始样品。对于RNA样品的定量，如基因表达或病毒RNA检测研究，cDNA生成前的处理和逆转录通常需要单独的步骤。这增加了手动操作，并有可能引入污染。为了处理这些组织，Fluidigm开发出了操作步骤，通过整合逆转录反应和检测试剂，能够在现有芯片上检测特定的RNA分子。”此外，Bio-Rad也即将推出一个数字PCR的一步法试剂盒。与逆转录之后再对cDNA进行分液不同，如今也能够先分RNA，再开展逆转录和PCR，这一切都在液滴中进行。

数字PCR的通量也在不断提高，未来，它还有望实现多重分析。专家预计在未来的三五年，它有可能从一个小众技术变成实验室的标准工具。不敢相信吗？生命科学发展如此之快，一切皆有可能。