人体p16基因甲基化检测试剂盒产品说明书

           YIJI人体p16基因甲基化检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI人体p16基因甲基化检测试剂是一种旨在通过化学方法使基因组中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）转变成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，经过甲基化特异性PCR扩增，探测到人体肿瘤抑制基因p16启动子  岛甲基化信息的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于人体肿瘤抑制基因p16相关的肿瘤表观遗传学研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，转化保证。

技术背景

在基因的启动子区域（promotor region）通常存在一些富含重复双核苷酸“”的区域，称为“岛”（ island）。在人类基因组内，存在有近3万个岛。这些岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构，更是DNA甲基化的唯一位置。岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。p16基因，又称为细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）或  ，是人体肿瘤抑制基因之一。其功能在于抑制CDK4激酶的活性，调节细胞周期。由于RNA剪切，p16具有三种转录体：  。一旦突变或甲基化，会造成细胞繁殖调控机制缺失，而致肿瘤或细胞衰老等。

产品内容

YIJI缓冲液（Reagent A）      毫升

YIJI变性液（Reagent B） 微升

YIJI处理液（Reagent C） 毫升

YIJI转化液（Reagent D） 毫升

YIJI封隔液（Reagent E） 毫升

YIJI净化液（Reagent F） 毫升

YIJI萃取液（Reagent G）   毫升

YIJI浓缩液（Reagent H） 毫升

YIJI助沉液（Reagent I） 微升

YIJI沉淀液（Reagent J） 毫升

YIJI清理液（Reagent K）   毫升

YIJI保存液（Reagent L） 毫升

YIJI扩增液（Reagent M） 微升

YIJI补充液（Reagent N） 毫升

YIJI U引物F（Reagent O） 微升

YIJI U引物R（Reagent P） 微升

YIJI M引物F（Reagent Q） 微升

YIJI M引物R（Reagent R） 微升

YIJI针筒离心柱 套

产品说明书  1份

保存方式

保存YIJI处理液（Reagent C）、YIJI转化液（Reagent D）、YIJI助沉液（Reagent I）、YIJI扩增液（Reagent M）、YIJI补充液（Reagent N）、YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里；YIJI净化液（Reagent F）和YIJI针筒离心柱保存在室温下；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI处理液（Reagent C）和YIJI转化液（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

2.0毫升离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽：用于孵育反应物

微型台式离心机：用于沉淀样品或去除杂质

涡旋震荡仪：用于混匀反应物

真空泵：用于去除样品中的液体成分

针筒挤压塞：用于去除样品中的液体成分

PCR仪：用于样品扩增

PCR管或平板：用于PCR反应的容器

测序试剂盒：用于测序前的产物处理

实验步骤

实验开始前，将YIJI处理液（Reagent C）和YIJI转化液（Reagent D）从－20℃冰箱中取出，置入室温下。同时将其中一管YIJI缓冲液（Reagent A）置入65℃恒温水槽中预热备用。然后进行下列操作：

一、 转化实验

1． 准备1个2.0毫升离心管

2． 加入2微克DNA样品

3． 加入适量的YIJI缓冲液（Reagent A）到50微升反应体系（注意：不要使用65℃预热的YIJI缓冲液（Reagent A））

4． 加入xx微升YIJI变性液（Reagent B），混匀

5． 放进37℃恒温水槽孵育12分钟

6． 加入xx微升YIJI处理液（Reagent C）（注意：可见溶液呈现黄色）

7． 在涡旋震荡仪上小心震荡30秒，充分混匀

8． 加入xx微升YIJI转化液（Reagent D），上下倾倒混匀

9． 加入xx微升YIJI封隔液（Reagent E）

10． 放进55℃恒温水槽孵育16小时

11． 小心抽去xx微升YIJI封隔液（Reagent E）

12． 加入xx毫升充分摇匀的YIJI净化液（Reagent F），上下倾倒混匀

13． 移入到针筒离心柱

14． 连接到真空泵，将柱内液体抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

15． 加入xx毫升YIJI萃取液（Reagent G）

16． 运用真空泵，将YIJI萃取液（Reagent G）抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

17． 重复实验步骤15至16一次

18． 去掉针筒，将离心柱放在1.5毫升离心管

19． 放进微型台式离心机离心20秒，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）

20． 加入xx微升65℃预热的YIJI缓冲液（Reagent A）到离心柱

21． 室温下静置1分钟

22． 放进微型台式离心机离心20秒，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）

23． 去掉离心柱

24． 加入xx微升YIJI变性液（Reagent B）到离心管，混匀

25． 放进37℃恒温水槽孵育12分钟

26． 加入xx微升YIJI浓缩液（Reagent H）

27． 加入xx微升YIJI助沉液（Reagent I）

28． 加入xx微升YIJI沉淀液（Reagent J）

29． 在涡旋震荡仪上强烈震荡30秒

30． 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）

31． 小心抽掉上清液

32． 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent K）

33． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）

34． 小心抽掉上清液

35． 空气中晾干沉淀颗粒群

36． 加入xx微升YIJI保存液（Reagent L）

37． 放进－20℃冰箱长期保存

二、甲基化特异性PCR

1． 将YIJI扩增液（Reagent M）、YIJI补充液（Reagent N）、YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）从－20℃冰箱里取出

2． 置入冰槽里直至融化

3． 针对一个样本，准备2个PCR管，分别标记为U和M管

4． 分别移出xx微升YIJI扩增液（Reagent M）到PCR管里

5． 分别加入1微升上述转化实验中获得的DNA样品（总量100纳克）

6． 分别加入xx微升YIJI U引物F（Reagent O）和YIJI U引物R（Reagent P）到U管中

7． 分别加入xx微升YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）到M管中

8． 再分别加入xx微升YIJI补充液（Reagent N）（反应总量为25微升）

9． 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）

10． 加入50微升PCR级矿物油（注意：参见注意事项9）

11． 即刻进行热启动PCR反应：

12． 反应完毕后，移取5微升进行1.8%琼脂糖凝胶电泳

13． 阳性条带：转化后非甲基型（U）――151 bp；转化后甲基型（M）――150 bp

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 建议使用带滤芯的枪头，避免污染

4． 一个特定基因的甲基化特异性PCR通常包括：转化后甲基型（M）、转化后非甲基型（U）

5． 甲基化特异性PCR的引物设计原则： 

6． YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）的信息如下：

7． 通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR扩增后的结果。假如DNA样品在修饰前是未甲基化的，那么仅仅“U”Primers将产生扩增产物；相反，已甲基化的DNA样品仅仅用“M”Primer能被扩增

8． 组织样品或杂合子样品常常出现“U”和“M”同时呈现阳性；建议使用YIJI基因甲基化程度定量分析试剂盒（YJ20024.3）予以分析

9． 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）

10． 必要时，可以调整Tm温度 

11． 在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融

12． 转化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融

13． 本公司同时提供系列基因甲基化分析试剂产品

14． 本公司提供系列甲基化分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定转化保证

3． 本产品经鉴定无核酶污染

4． 本产品经鉴定反应产量高

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