721分光光度计的使用

【实验原理】

光的本质是电磁波。不同的光，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400-750nm，小于400nm的光线为紫外线，大于750nm的光线称为红外线。

光线通过透明溶液介质时，一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液后光波部分减少。这种光波的吸收和透过可用于物质的定性定量分析。吸光分析依据的是Lambert和Beer定律。

一、Lambert定律 

一束单色光通过透明溶液时，一部分的光波被吸收，被吸收光波的量与溶液厚度有一定比例关系。

I = I0e-al…………………………………………………  ⑴

式中I0为入射光强度

I为通过溶液后的光强度

l为溶液的径长

e为自然对数的底，即2.718

a为溶液的吸光率

（1）式可改写为：

ln（I0/I）= al ……………………………………     (2)

将（2）式换算成常用对数式，即

log（I0/I）= 0.4343·al

令K = 0.4343·a

则log（I0/I）= Kl………………………………………(3)

此处以K为吸光率。

二、Beer定律 

以溶液中溶质浓度变化代替溶液厚度的改变，光波的吸收与溶质浓度的改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质浓度有一定比例关系。依据Lambert定律中同样的推导，可得出下式。

log（I0/I）= KC……………………………………      (4)

式中c为溶液中溶质的浓度。

Lambertp定律和Beer定律合并，即(3)和(4)式合并为

log（I0/I）= KCl…………………………………………(5)

令T =（I/I0）  A = log（I0/I）

则A = KCl…………………………………………………(6)

式中A为吸光度，T为透光度

(6)式为Lembert-Beer定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中的溶质的浓度和溶液厚度成正比。此式为吸光分析法的基本计算式。

三、721A型分光光度计仪器介绍

目前科研和临床最常用的分光光度仪器（可见光区）是721分光光度计。

721A型分光光度计采用自准式光路，单光束方法。光谱范围在360～800nm。以钨丝灯泡为光源，经透镜聚光后射入单色器内，再经棱镜色散后，反射到准直镜，穿狭缝得到波长范围更窄的光波作为入射光，进入比色池透出的光波被光电管接受，产生光电流。经微电流放大器送至对数放大器，由对数放大器变换成常用对数值输出，再送至浓度调节器，数字面板表面通过切换开关分别选择微电流放大器的输出、对数放大器的常用对数输出及浓度调节器的输出信号进行透射比（T）、光密度（A）和浓度（C）的显示。

下面分别简述仪器主要部件，并附“结构示意图”和“仪器外形图”。

1.光源：以12V25W卤钨灯泡为光源。

2.单色器组件：包括光缝片（园弧形的两片）、棱镜、准直镜、凸轮、波长盘、入射光与出射光调节部件等。是仪器的主要部件之一。

3.试样池（比色皿）：进光婧统龉饷娼杂晒庋РＡе瞥桑约跎俟獾纳⑸洌殖置嫖煌腹獾拿ＡА１壬蟮墓娓裎?SPAN lang=EN-US>0.5、1、2、3厘米4种。

4.受光器：不是光电比色计的光电池而是光电管。它的阴极表面有一层对光灵敏的物质，光照射到光电管后，会发射出光电子，此光电子向阳极运动，形成光电流。光电管的灵敏度虽比光电池小，但经光电管出来的光电流可以放大，而经光电池出来的光电流不易放大，并且光电池易疲乏，故较高级的分光光度计均采用光电管作受光器。

5.检测系统：包括对数放大器，浓度调节器和数字面板显示表。

【实验准备】

一、器材

1.擦镜纸或棉花、滤纸片。

2.1厘米的比色皿，铺有滤纸的表面皿或培养皿。

3.220V交流电源，外接地线牢固。

4、721A型分光光度计，配有仪器布罩。

二、试剂

1.蒸馏水或空白试剂（B）。

2.不同浓度的同种颜色透明溶液两份，用作标准液（S）及待测液（U）。

【实验操作】

1.检查721A型分光光度计的旋钮和开关，使其回复零点。

2.按要求接通电源，按下“T键”，打开暗盒盖和电源开关，指示灯亮。预热20分钟。

3.调节波长旋钮至所需波长。

4.取比色皿分别盛装B、S、U液，置入检测室（比色皿先用蒸馏水洗后，再用比色液润洗才能装比色液）。B液对准光路。

5.调节面板“零位细调”，使指示为00.0，即透射比“T”的零点，同时“一”号闪跃。

6.合下检测室盖.调节“光量粗、细调”电位器，使指示为100.0，须反复5、6两点操作达到稳定。

7.按下“A”键，指示为“.000”同时“一”闪跃，如果指示读数不是比值时，应调节“消光调零“电位器，使其达到要求。

8.拉出或推入拉杆，使U、S液分别置于光路读取A值，然后移动拉杆，读B管A值，如为0，则前述A值有效。

9.在稳定时，重复读数一次，并按下“T”键。

10.打开检测室盖，取出比色皿，倾去比色液于水槽中，用自来水冲洗干净，倒置于表面皿（铺有滤纸）中。

11.关上电源开关，拔出电源插头，取出比色皿架，检查检测室内是否有液体溅出，并擦净。检测室内放入硅胶袋，合上盖，套上仪器罩。

【计算】

1.利用标准管计算测定物含量 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据（6）式计算，即

A1= K1C1l1              A2= K2C2l2

式中A1、A2分别为已知浓度标准和未知浓度测定吸光度。

c1、c2分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管中测定物浓度。

因盛标准液和测定液的比色杯径长相同（l1=l2），故上二式可写成：

A1/K1C1= A2/K2C2……………………………………………(7)

因标准液和测定液中溶质为同一物，K值相同，即：

（7）式可换算成下式：

C2=（A2/A1）× C1   …………………………………………(8)

因测定液和标准液在处理过程中体积相同，故（8）式可写成：

m2 =（A2/A­1）וm1…………………………………………(9)

式中m1、m2分别表示标准液和测定液中待测物的含量。

（9）式为实验操作中常用计算式。

2.利用标准曲线进行换算 先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度，以各管吸光度为纵轴，各管溶液浓度为横轴，在方格座标纸上作图得标准曲线。以后进行测定时，就无需再作标准管，以测定管吸光度从标准曲线上可求得测定物的浓度。

一般认为，标准曲线范围在标准管测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05-1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，有时尽管型号相同，操作条件完全一样，因不是同一台仪器，其结果会有一定误差。

3.利用摩尔吸光率ε求测定物浓度  (6)式中K为吸光率，当浓度c为1mol/L，溶液厚度L为1cm时，则称为摩尔吸光率，以ε表示，此时ε与A相等。

实际应用中测定物常以g/ml作浓度单位。已知ε情况下，读取测定液径长为1cm时的吸光度，根据下式可求出测定液的物质浓度。C = A/ε

此计算式常用于紫外吸收法，如蛋白质溶液含量测定，因蛋白质在波长280nm下具有最大吸收峰，利用已知蛋白质在波长280nm时的克分子吸光率，再读取待测蛋白质溶液的吸光度，即可算出待测蛋白质的浓度，无需显色，操作简便。

【注意事项】

1.仪器须安放在稳固的工作台上，不能随意搬动。严防震动，潮湿和强光直射。

2.盛装比色液时，约达比色皿2/3体积，不宜过多或过少。若不慎使溶液流至比色皿外面须用棉花或拭镜纸擦干，才能放入比色架。拉比色杆时要轻，以防溶液溅出，腐蚀机械。

3.千万不可用手或滤纸等物摩擦比色皿的透光面。

4.比色皿用后应立即用自来水冲洗干净，若不能洗净，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鲜配制的重铬酸钾洗液短时间浸泡，然后用水冲洗干净，倒置晾干。

5.每套分光光度计上的比色皿和比色皿架不得随意更换。

6.试管或试剂不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。

7.如果试剂溅在仪器上，应立即用棉花或纱布擦干。

8.测定溶液浓度的光密度值宜在0.1—0.7之间最符合光吸收定律，线性好，读数误差较小。如光密度超过0.1—1.0范围，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，再进行比色。

9.合上检测室盖连续工作的时间不宜过长，以防光电管疲乏。每次读完比色架内的一组读数后，立即打开检测室盖。

10.仪器连续使用不应超过2小时，必要时间歇半小时再用。

11.测定未知液时，先作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定波长。

12.721分光光度计的放大器暗盒及单色器箱处放有两个硅胶筒，检测室内放硅胶袋，应经常检查，发现硅胶变色，应更换新硅胶或烘干再用。

13.仪器较长时间不使用，应定期通电、预热。

14.仪器用完之后，须拔去电源，套上仪器罩。