产品描述

MSCgo?成人骨髓间质干细胞成软骨诱导分化培养基试剂盒，不含血清，无异源，适用于不同来源的MSC，如骨髓、软骨组织和脐带组织；hMSC-BM，hMSC-AT，hMSC-CT

成软骨结果

3D培养hMSC分化成软骨细胞，典型的细胞外基质富集蛋白多糖，形成软骨。蛋白多糖可以作为软骨形成的一个指标，并且可以Alcian Blue（深蓝色的含铜染料）染色检测。Alcian Blue染色是成熟软骨细胞的标志。不同的hMSC（细胞类型、年龄、代数）染色强度不一致。

试剂盒组成

MSCgo?间质干细胞成软骨诱导分化培养基试剂盒

完全培养基配制

1       室温下解冻Supplement Mix。

2       将Supplement Mix 用1：10倍的Chondrogenic Basal Medium稀释（如：10ml Supplement Mix+90ml Basal Medium）。

3       完全培养基可在2-8°C储存一个月。

所需材料

? MSCgo? Chondrogenic Differentiation: BI; 05-220-1 and 05-221-1.

? 96-well U-bottom, 非组织培养处理的板（悬浮培养）。（BD FALCON; 35-1177, 或 CELLSTAR; 650185 Greiner）

? MSC NutriStem? XF : BI; 05-200-1 and 05-201-1.

? 可选- Alcian Blue 8 GX (Sigma; A-3157)。建议选择Vivacell品牌，间充质干细胞成软骨分化染色试剂盒，货号： C37B00150。

成软骨诱导分化操作

1.     接种hMSC，3D培养在 96-well U-bottom 培养板中每孔加入100μl MSC NutriStem? XF，接种1x105细胞 (30-40x104 cells/cm2)。无需预包被。

注意：微量培养技术也是一个选择并且可以激发球形细胞的形成：接种10μl 1x107cells/ml 入板的中心（最终1x105cells/well），使其贴壁2小时，然后加入培养基0.1ml/well。

2.     置于37°C，5% CO2培养箱中培养。在24-48小时内会自发形成球状体。

3.     分化：培养24小时后，将MSC NutriStem? XF培养基吸除，每孔加入0.2ml分化培养基。

4.     置于37°C，5% CO2培养箱中培养14-21天。

注意：培养时间长，将得到更成熟的软骨细胞（Alcian Blue染色强度更大）。

5.     每3-4天更换分化培养基（0.2ml/well）。

注意：小心不要吸入球状体。

6.     评估软骨形成：使用Alcian Blue染色。蛋白多糖-软骨形成的标志，被染成深蓝色。

Alcian Blue染色操作（可选）

制备1% Alcian Blue 溶液

l  将0.2g Alcian Blue 8 GX (Sigma；A-3157)溶解于20ml 99%异丙醇0.1N HCl中。

l  用0.45 μm注射器(如：Minisart 16555)过滤。

l  溶液置于2-8°C储存一年。

Alcian Blue染色过程

注意：小心操作不要吸入球状体。

l  吸除培养基，用DPBS洗一次（BI；02-023-1，0.2ml/well）

l  固定：吸除DPBS，每孔加入0.2ml 10% 福尔马林（4% 甲醛）。室温固定30-60分钟。

l  吸除福尔马林，每孔用0.2ml 蒸馏水洗涤2次。

l  吸除蒸馏水，每孔加入0.2ml 1%Alcian Blue染色工作液。室温过液，注意避光。

l  吸除染液，每孔用0.2ml 0.1N HCl洗涤2-3次。

l  吸除HCl，每孔加入0.2ml 蒸馏水。

l  观察成软骨染色效果，图像采集，及软骨形成评估。

注意：软骨含有蛋白多糖保持蓝色，而球状体不含蛋白多糖在洗涤步骤中失去染色。

半定量Alcian Blue染色（可选）

l  每孔用0.15ml 8M Guanidine HCH溶液（GuHCl，Sigma；G9284）洗脱染料。

l  2-8°C过夜。

l  600nm 测OD值（8M Guanidine HCH溶液作为空白对照）。