DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发，不具有5'－3'外切酶活性及3'－5'外切酶活性，有5'－3'聚合酶活性），β（定位于核内，参与高保真度复制，不具有5'－3'外切酶活性，其中疑似存在5'－3'聚合活性，不具3'－5'外切酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制，均具有5'－3'外切酶活性、5'－3'聚合活性及3'－5'外切酶活性），δ（定位核，参与延长子链及错配修复，均具有5'－3'外切酶活性、5'－3'聚合活性及3'－5'外切酶活性），ε（定位于核，参与损伤修复，均具有5'－3'外切酶活性、5'－3'聚合活性及3'－5'外切酶活性）。
原核细胞：在大肠杆菌中，到目前为止已发现有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长，于1956年发现；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ直到1999年才被发现。



发现

在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事们就想到DNA的复制必然是一种酶的催化作用，于是决心分离出这种酶并研究其结构和作用机制。为了达到这个目的，他们分离的蛋白，然后加到体外合成系统中即同位素标记的dNTP、Mg2+及模板DNA，经过大量的工作，于1956年终于发现了DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，DNA pol Ⅰ）原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。开始人们以为DNA pol I是细菌中DNA复制主要的酶类，后来发现DNA pol Ⅰ的突变株照样可以复制，才清楚它并不是主角。现已知道在DNA复制中起主导作用的是DNA pol Ⅲ，至于pol Ⅱ的功能如今还不十分清楚。DNA聚合酶的共同特点是：
⑴需要提供合成模板；⑵不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；⑶合成的方向都是5'→3'⑷除聚合DNA外还有其它功能。
所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3'－OH上加核苷酸使链延伸，其速率为1000 Nt/min。加什么核苷酸是根据和模板链上的碱基互补的原则而定的。
E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用。DNA pol Ⅱ在修复损伤中也是有重要的作用。DNA pol Ⅲ是一种多亚基的蛋白。在DNA新链的从头合成（de novo）中起复制酶的作用。


共性

此酶最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的共同性质是：[1]以脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA;[2]需要模板和引物的存在;[3]不能起始合成新的DNA链；[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端；[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。下面首先介绍大肠杆菌的DNA聚合酶，然后简略说明一下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。


功能

[1]聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。
[2]3'→5'外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3'末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3'→5'外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。
[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用：5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。
[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。（dNMP)n+XPPi←（dNMP)n-x+X(dNPPP）→DNA
[5]焦磷酸交换作用：催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA
最后两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。
DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移（Nick translation）。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的DNA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。
尽管DNApolⅠ是第一个被鉴定的DNA聚合酶，但它不是在肠杆菌中DNA复制的主要聚合酶。主要证据如下：[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二倍数量级；[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色体DNA复制不正常；[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA复制却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。