三聚氰胺HPLC检测方法之固相萃取（SPE）法

1. 依据：GB/T 22388—2008
2. 原理：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
3. 试剂与材料：除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1甲醇：色谱纯；
3.2乙腈：色谱纯；
3.3氨水：含量为25％～28％；
3.4三氯乙酸；
3.5柠檬酸。
3.6辛烷磺酸钠：色谱纯；
3.7甲醇水溶液：准确量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混匀后备用；
3.8三氯乙酸溶液（1％）：准确称取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用；
3.9氨化甲醇溶液（5％）：准确量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混匀后备用；
3.10离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L 备用。
3.11三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%；
3.12三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，于4℃避光保存。
3.13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相当者。
3.14 定性滤纸。
3.15 微孔滤膜：0.2 μm，有机相。
3.16 氮气：纯度大于等于99.999％
4. 仪器和设备
4.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
4.2 分析天平：感量为0.00001 g和0.01 g。
4.3 离心机：转速不低于10000 r/min。
4.4 天津恒奥超声波提取器。HS,HU系列
4.5 上海禾工固相萃取装置。HGC-8
4.6 天津恒奥氮吹仪。HGC,HSC系列
4.7 天津恒奥涡旋振荡器。HMS-350
4.8 天津恒奥真空泵。HPD-25
4.9 天津恒奥精密气体稳流调节阀。
4.10 具塞塑料离心管：50 mL。
5. 样品处理
5.1 提取
称取（液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等）2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.8）和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于10000 r/min离心30 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。
注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。
5.2 活化
依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化（3.13）阳离子交换固相萃取柱。旋转固相萃取装置前的精密气体稳流调节阀使洗液流速不超过1 mL/min
5.3 上样
将5.1中的待净化液转移至固相萃取柱（5.2）中。
5.4 淋洗
依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，
5.5 洗脱
用6 mL氨化甲醇溶液（3.9）洗脱，用试管收集洗脱液。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。5.6 浓缩
洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。
6. 高效液相色谱测定
HPLC 参考条件
a） 色谱柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者。
b） 流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（85+15，体积比），混匀。
C18柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（90+10，体积比），混匀。
c） 流速：1.0 mL/min。
d） 柱温：40℃。
e） 波长：240 nm。
f） 进样量：20 μL。
7. 分析
用GB/T 22388—2008标准检测方法分析，使用天津恒奥的设备测得样品的回收率结果如下：
添加水平（mg/Kg）回收率
空白
2 116%
4 108%
6 92%
8 96%