RNAi慢病毒载体构建

（一.）慢病毒载体构建
慢病毒（Lent virus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
（二）病毒包装、扩增：
将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体，与辅助载体一起转染293T细胞进行包装；
将包装好的病毒超速离心收集；
将浓缩病毒进行滴定，滴定结果单位为PFU/ml（一般为5×108 PFU/ml以上，体积为500μl以上，根据客户需要，不同量有价格差异）
二、质量控制与鉴定：
测序鉴定
根据特定引物作RT-PCR鉴定
蛋白表达鉴定（根据客户要求并由客户提供高特异性抗体）
三、客户须知：
对于客户所要构建腺病毒的目的基因，客户须提供详细的基因相关信息，包括基因序列，载体序列，载体图谱。载体构建步骤所需时间，根据不同构建方案，需15到25个工作日。从合同签订之日起，客户需交纳首期技术服务费（50%服务费），方可进行实验。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料：
插入目的片段序列信息，原始载体序列信息，载体图谱，酶切分析图等。
鉴定正确的原始质粒，PCR引物及PCR鉴定方法说明（包括PCR体系及PCR条件）（非必需，或需协商），测序引物（非必需，或需协商）。
原始质粒的酶切鉴定报告、测序报告，如果客户确定基因的信息无误，这条非必需。
实验目的、要求，目的基因有无细胞毒性，是否需要构建对照病毒？
实验要求包括：
是否自行构建腺病毒载体？是否要求更换启动子、polyA等基因元件？
实验目的包括：
用于细胞实验还是动物实验，需要感染的细胞类型或动物模型类型。
四、我们的承诺：
构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装，扩增的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
提供重组穿梭载体或者siRNA载体，重组腺病毒载体的酶切及测序报告。
免费提供一管阴性对照（仅限通用型的，如果客户指定的序列，需要另外计费）。
最大插入片段5kb－8Kb。
补充说明：
如果客户需更换启动子，需保证所插入的基因的表达产物对细胞无毒害作用，
如果插入的目的片段太长，客户要求测序验证全长，需要提供基因的特异引物，以测得全长，加收一定的费用。