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Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng) 12207ES08
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng) 12207ES08
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Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng) 12207ES08

产品报价:1355元

更新时间:2019/3/21 15:49:23

地:上海

牌:翊圣生物

号: 12207ES08

厂商性质: 生产型,贸易型,服务型,

公司名称: 上海翊圣生物科技有限公司

产品关键词: NGS   磁珠纯化与分选   DNA片段化  

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翊圣生物 : (13916926566) (400-6111-883)

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Hieff NGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina?

(for 50 ng)

产品信息

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS?   Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 50 ng)

12207ES08

8 T

1355.00

12207ES24

24 T

6155.00

12207ES96

96 T

23855.00

产品描述

Hieff NGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 50 ng)是针对lllumina?高通量测序平台专业开发设计的转座酶法建库试剂盒,适用于50 ng的基因组DNAcDNA、扩增子(>500 bp)等样本的建库。与常规分步法建库相比,Hieff NGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina?采用新型转座酶和优化的缓冲体系,仅需10 min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程,显著缩短建库时间至1.5小时以内,并获得优异的测序质量。此外,本试剂盒已经不同GC含量DNA样本的验证,无偏好性或仅具有极低的偏好性。本试剂盒提供的所有试剂盒组分,都经过严格的质量与功能验证,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

产品组分

组分编号

组分名称

8 libraries

24 libraries

96 libraries

12207-A

5×Reaction Buffer

80 μL

240 μL

960 μL

12207-B

Transposome Mix V50

40 μL

120 μL

480 μL

12207-C

6×Terminate Solution

80 μL

240 μL

960 μL

12207-D

PCR Primer Mix

24 μL

72 μL

288 μL

12207-E

2×Super Canace Mix

200 μL

600 μL

2400 μL

12207-F

N5 (N501)*

8 μL

——

——

12207-G

N7 (N701)*

4 μL

——

——

12207-H

N7 (N702)*

4 μL

——

——

注意:*测序时Index序列N501-TAGATCGCN701-TAAGGCGAN702-CGTACTAG

运输与保存方法

冰袋运输。

所有组分-20°C保存,有效期1年。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打或轻轻振荡混匀,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

 

二、关于产品原理

本产品基于转座酶法开发,其核心原理是转座酶及其转座机制。在Transposome Mix中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时,该转座子将Adapter 1Adapter 2接头序列插入靶基因中,形成一端带有Adapter 1,一端带有Adapter 2DNA,之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经N5N5XX)和N7N7XX)以及P5P7PCR Primer Mix)两对引物扩增,产物经分选和纯化后即为可测序文库。

1  Fast Tagment DNA建库试剂盒原理

三、关于DNA片段化(DNA Tagment

1. 本试剂盒使用转座酶进行DNA片段化。如DNA样品为PCR产物,应保证其长度>500 bp。因转座酶无法作用于DNA末端,因此PCR产物最末端50 bp测序覆盖度可能会有所降低。我们推荐您在制备PCR产物时将待测区域两末端各延长50-100 bp,以避免末端测序覆盖度降低的情况。

2. 本试剂盒适用50 ng Input DNA。在Input DNA投入前,应将其纯化并溶于灭菌蒸馏水中,A260/A280 = 1.8-2.0,并使用基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit?PicoGreen?等进行定量。【注意:因Transposome MixDNA浓度非常敏感,所以准确的DNA浓度测定对实验成功与否至关重要。】

四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

5. 磁珠使用过程中,应保证移液准确性。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增(Library Amplification

1. 使用本试剂盒必须进行文库扩增步骤。因转座反应产物并非完整的双链DNA文库,必须通过PCR反应生成完整的DNA文库。

2. Input DNA量为50 ng时,推荐使用5-9个扩增循环,7个循环的文库产出约为600 ng

六、关于文库质检(Library Quality Analysis

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit?PicoGreen?等;基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit?PicoGreen?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop?等。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601Hieff NGS? DNA Selection BeadsCat#A63880AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. N5N5XX)和N7N7XXIndex引物: Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina? (96 Index)Cat#12610ES96)。

4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer10 mM Tris-HClpH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

        

2  Fast Tagment DNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 DNA片段化(DNA Tagment

1. 准备工作:将Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer6×Terminate Solution室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

片段化反应体系

名称

体积(μL

50 ng Input DNA

x

5×Reaction Buffer

10

Transposome Mix V50

5

ddH2O

Up to 50 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表2所示反应程序,进行片段化反应。

 

片段化反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

55°C

10 min

4°C

Hold

5. 终止反应:立即向反应物中加入10 μL 6×Terminate Solution,使用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心,55℃反应10 min,如表3

终止反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

55°C

10 min

4°C

Hold

6. 片段化产物纯化

1)将平衡至室温的Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀,以1.0×比例回收上述片段化产物。

2)吸取60 μL磁珠加入上述60 μL片段化产物中,使用移液枪轻轻吹打混匀,室温孵育5 min

3)将PCR管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

4)保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后小心移除上清。

5)重复步骤4),总计漂洗两次。

6)保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

7)将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置孵育5 min

8)将反应管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清(约5 min)后小心吸取20 μL上清至干净的灭菌PCR管中。

7. 立即进行步骤3.2,文库PCR富集。

3.2 文库扩增(Library Amplification

1. 将表4中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用

2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。

4  PCR扩增反应体系

名称

体积(μL

步骤三纯化产物

20

PCR Primer Mix

3

N5XX*

1

N7XX*

1

2×Super Canace?   Mix

25

ddH2O

Up to 50 μL

注意:*Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina? (96 Index)Cat#12610ES96)中提供8N5XX12N7XX,可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. PCR管置于PCR仪中,设置表5所示反应程序,进行PCR扩增

 

5  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

热盖105°C

On

——

72°C

3 min*

——

95°C

30 sec

——

95°C

10 sec

n cycles**

55°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

——

4°C

Hold

——

注意:*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循环数请根据测序需要进行选择。起始DNA量为50 ng时,推荐5-9个扩增循环。

3.3 文库纯化或分选(Library Clean Up/Size Selection

如对文库长度分布无特殊要求,可直接使用1.0×磁珠纯化扩增产物(参照步骤3.16.片段化产物纯化步骤),而不进行片段分选如需进行片段分选,则进行以下步骤,推荐使用Cat#12601 DNA Selection Beads进行产物片段分选,为防止接头或大.片段残留,可进行两次片段分选,或先使用1.0×磁珠纯化扩增产物后再进行分选。

1. 将平衡至室温的Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀。

2. 根据DNA片段长度要求,进行双轮分选时,需将初始DNA样本用灭菌蒸馏水补齐至100 μL,参考表6推荐比例向文库上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温孵育5 min。【注意:因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50 μL,进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至100 μL,否则分选长度会与预期不一致。】

磁珠文库分选推荐比例

文库平均总长度

~300 bp

~400 bp

~500 bp

~800 bp

第一轮磁珠用量

80 μL (0.8×)

70 μL (0.7×)

60 μL (0.6×)

50 μL (0.5×)

第二轮磁珠用量

20 μL (0.2×)

20 μL (0.2×)

20 μL (0.2×)

15 μL (0.15×)

注意:“×”数均根据PCR产物体积补齐至100 μL计算而得,如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL

3. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

4. 参考表6向上清中加入第二轮分选磁珠。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min

6. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

8. 重复步骤7,总计漂洗两次。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

10. PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min

11. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中,于-20℃保存。此外,如需获得长度分布更集中的文库扩增产物,可使用胶回收方式进行长度分选和纯化;如对文库长度分布范围等无特殊要求,扩增产物也可不进行长度分选,直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。

3.4 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

3.5 参考实例

使用Hieff NGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina?50 ng嗜盐杆菌gDNA样本建库,并分别使用1.0×磁珠进行纯化,0.8×/0.2×0.7×/0.2×0.5×/0.15×磁珠比例进行长度分选,结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

PS-Tn5建库分选2100-3 2018.1

3  Agilent 2100 Bioanalyzer文库质量分析

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