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His标签蛋白纯化预装柱,5ML20504ES08
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  • His标签蛋白纯化预装柱,5ML20504ES08

His标签蛋白纯化预装柱,5ML20504ES08

产品报价:728元

更新时间:2024/3/25 11:30:24

地:上海

牌:翌圣生物

号:20504ES08

厂商性质: 生产型,贸易型,服务型,

公司名称: 翌圣生物科技(上海)股份有限公司

产品关键词: His标签亲和纯化凝胶)   蛋白纯化预装柱   缓冲液  

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翌圣生物科技(上海)股份有限公司 : (13916792673) (400-6111-883)

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HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML

His标签蛋白纯化预装柱,5ML

产品信息

产品名称          

产品编号

规格

价格(元)

HisSep   Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML

His标签蛋白纯化预装柱,5ML

20504ES08

5 mL

728.00

20504ES25

5 mL×5

2938.00

产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外,因其基质的耐压性(该基质可以耐受最高0.3 MPa的压力),该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化,可在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一种以HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF为填料的中压预装柱,该预装柱具有标准接口,可以适配商品化的各类中压色谱系统,如?KTA等,方便客户用于纯化His-tag蛋白。

产品性质

基质(Matrix

高度交联的6%琼脂糖凝胶

粒径(Bead size

45-165 μm

载量(Capacity

>40 mg   6×His-tagged protein/mL基质

耐压(Tolerance Pressuremax

0.3 MPa3 bar

储存缓冲液(Buffer

20%乙醇的1×PBS

柱子尺寸(Column Size

1.6×2.5 cm5 mL

运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存。有效期2年。

注意事项

1)建议纯化所用缓冲液和蛋白溶液经0.22 μm0.45 μm滤膜过滤后上柱使用。

2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

(一)纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 μm0.45 μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2

2 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达蛋白为例)

1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSFPMSF在破碎前加入,其终浓度为1 mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysSpLysE,可以不加入溶菌酶。 

4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10 μg/mL RNase A5 μg/mL DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

5)收集上述澄清蛋白液,10000 rpm4℃离心20-30 min。取上清,0.22 μm/0.45 μm滤膜过滤,置于冰上备用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶,5000 rpm离心10 min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】:对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)

1)将培养液转移至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体去上清。

2)按照菌体:裂解液=1:10w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。

3)将破碎液转移至离心管,10000 rpm4℃离心20-30 min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。

4)按照菌体:裂解液(含8 M尿素)=1:10w/v)的比例将包涵体充分悬浮。

5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 样品纯化(以AKTA使用为例)

1)将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞,连接至色谱系统中,再折断下口,将预装柱连接到色谱系统中,注意旋紧。

23-5倍柱体积去离子水冲洗出存储缓冲液。

3)至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。推荐流速为5 mL/min

4)利用泵或注射器上样。【注】若样品粘度增加,即使上样体积很少也会导致层析柱很大的反压;上样量不要超过柱子的结合能力;大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。

5Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。

  【注】在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。

7)建议用更高浓度咪唑(如500 mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。

(二)在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-PlaceCIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液,接触时间为1-2 h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。

(三)填料再生

当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa),填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:

1)使用0.2 M 醋酸溶液(含6 M GuHCl)清洗2倍柱体积;

2)去离子水清洗5倍柱体积;

32%SDS清洗3倍柱体积;

4)去离子水清洗5倍柱体积;

5)乙醇清洗5倍柱体积;

6)去离子水清洗5倍柱体积;

7100 mM EDTApH 8.0)清洗5倍柱体积;

8)去离子水清洗5倍柱体积;

9100 mM NiSO4清洗5倍柱体积;

10)去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。

 

附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1 L溶液所需各种试剂量

Lysis BufferpH 8.0

50 mM NaH2PO4  

300 mM NaCl

10 mM imidazole

NaOHpH8.00.22 μm0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4   ·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         0.68 g

Wash BufferpH 8.0

50 mM NaH2PO4  

300 mM NaCl

20 mM imidazole

NaOHpH8.00.22 μm0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4   ·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         1.36 g

Elution BufferpH 8.0

50 mM NaH2PO4  

300 mM NaCl

250 mM imidazole

NaOHpH8.00.22 μm0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4   ·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         17.0 g

 

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1 L溶液所需各种试剂量

Lysis BufferpH 8.0

8 M Urea

100 mM NaH2PO4  

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH8.00.22 μm0.45 μm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO4   ·2H2O    15.6 g

Tris                15.76 g

Wash BufferpH 6.3

8 M Urea

100 mM NaH2PO4  

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH6.30.22 μm0.45 μm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO4   ·2H2O    15.6 g

Tris                15.76 g

Elution BufferpH4.5

8 M Urea

100 mM NaH2PO4  

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH4.50.22 μm0.45 μm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO4   ·2H2O    15.6 g

Tris              15.76 g 


附表
3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF试剂耐受情况

试剂种类

浓度

还原剂

5 mM DTE

0.5-1 mM DTT

20 mM β-mercaptoethanol

5 mM TCEP

10 mM reduced   glutathione

变性剂

8 M urea

6 M Gua-HCl

去污剂

2% TritonTM   X-100nonionic

2% TweenTM20nonionic

2% NP-40nonionic

2% Cholateanionic

1% CHAPSzwitterionic

其他类

500 mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100 mM Na2SO4

1.5 M NaCl

1 mM EDTA

60 mM citrate

缓冲液

50 mM sodium   phosphatepH 7.4

100 mM Tris-HClpH 7.4

100 mM   Tris-acetatepH 7.4

100 mM HEPESpH 7.4

100 mM MOPSpH 7.4

100 mM sodium   acetatepH 7.4 


附表
4 问题及解决方案

问题

可能原因

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中可能含微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22 μm0.45 μm)过滤,或离心去除

样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5   μg/mL),Mg2+(终浓度1 mM),冰上孵育10-15 min

样品太黏稠

有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。

洗脱组分中无目的蛋白

蛋白可能是包涵体

可通过电泳检测裂解液,分析上清中是否有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式

表达量太低

优化表达条件,使用包涵体纯化缓冲体系

目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来

提高Wash BufferpH值,或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来

降低Elution Buffer pH,或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度

使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到蛋白

蛋白降解

菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂

4℃下进行纯化操作

洗脱组分不纯(含多种蛋白)

洗杂不彻底

增加Wash Buffer 体积

样品中含有其他His标签蛋白

通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。

填料颜色变浅或变成白色

镍离子脱落或者剥离

按照填料再生的操作重新挂镍离子

填料呈现褐色

缓冲液中含有DTT等还原剂

参考附3适当降低还原剂DTT的浓度,或改用巯基乙醇

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样

蛋白发生聚集

在样品和所有缓冲液中添加稳定剂,如0.1%Triton X-100Tween-20

 

相关产品

产品名称

货号

规格(mL

价格(元)

HisSep Ni-NTA   Agarose Resin

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20502ES10/50/60

10/50/100/1000

678/2848/5328/42686

HisSep Ni-NTA   Agarose Resin 6FF

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20503ES10/50/60/80

10/50/100/1000

798/3358/5838/44686

HisSep Ni-NTA 6FF   Chromatography Column, 5mL

His标签蛋白纯化预装柱,5 mL

20504ES08/25

5/5×5

728/2938

HisSep Ni-NTA 6FF   Chromatography Column, 1mLHis标签蛋白纯化预装柱,1 mL

20505ES03/08

1/5×1

298/1048

Anti-His Affinity   GelAnti-His标签亲和纯化凝胶)

20589ES03/08/25/60

1/5/25/100

4356/13756/62786/189756

HB181205


 


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