pBM40 Toposmart Cloning Kit（20次）

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CL111-01	pBM40 Toposmart Cloning Kit	20次	680	{/else}暂无
CL111-02		20次×3	1800

保存条件：-20℃保存一年。

产品介绍：

 利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM40哺乳动物表达载体中。适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。引物CMV forward和SV40PolyArev可用于菌落PCR和测序鉴定。

产品特点：

    1）平末端PCR产物的快速、高效、定向克隆，连接反应仅需5-30分钟。

    2）具有CMV启动子，适用于外源基因在哺乳动物细胞中的表达，带新霉素抗性基因，便于稳转细胞株的筛选。

    3）C端带FLAG标签序列便于表达的目的蛋白质的检测

    4）相对于pcDNA3.1等其它哺乳动物表达载体，pBM40载体具有更小的质粒骨架，转染效率高。

注意事项：

    (1)引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。上游引物的5’端添加CACC四个碱基（CACC为真核表达所必需的Kozak序列）。如果目的蛋白需要在C端带FLAG标签，下游引物则需要去掉基因本身  的终止密码子（3个碱基），目的蛋白的翻译终止由FLAG标签的终止密码子TAA（位于Xho I酶切位点前）来实现。

   (2)DNA聚合酶：选用Pfu、Phusion、Q5、KOD和Xerox 等高保真DNA聚合酶用于PCR扩增。

   (3)连接时间：       

      ①片段大小为0.1-1kb(含1kb):5-10分钟     ②片段大小为 1-2kb(含2kb):10-15分钟

      ③片段大小为 2-3kb(含3kb):15-20分钟     ④片段大小大于3kb:30分钟

   如片段为切胶回收产物，反应时间取最大值。例如回收片段长度为1.5kb，反应时间设为15分钟。

   (4)连接温度：室温 (22℃-37℃)，可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25℃。若片段存在高GC等复杂结构，可在37℃反应。

  (5)产物要求：为保证PCR产物完整，建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度，如PCR产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带，无引物二聚体，可取1-3ml的PCR产物直接连接。但若扩增模板为质粒DNA，应注意质粒的抗性。由于pBM40载体为卡那抗性，以氨苄抗性的模板质粒扩增的PCR产物直接连接后的产物可涂布在卡那抗性的LB平板上。以卡那抗性的模板质粒扩 增的PCR产物应切胶回收后再连接。

 (6)片段用量：胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。表达产物大小为26.9kD。

  (7)分别往CMVPforward引物干粉管和SV40PolyArev引物干粉管加入100ml和108ml灭菌水就可以得到5mM浓度的引物。

（具体操作详见说明书）