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商品编号:72126
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BI MSC无血清培养基 05-200-1A/B,05-201-1U/06

价    格:询价

产    地:其他国家更新时间:2019/7/15 13:41:34

品    牌:BI型    号:05-200-1A/B,05-201-1U/06

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山东博科干细胞应用研究院有限公司

联 系 人:母经理

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等     级: (第 5年)

性     质:生产型,贸易型,

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间充质干细胞无血清培养基

  MSC NutriStem? XF Medium

 

一、目的:利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞

二、材料:新生儿脐带

三、主要仪器:医用手术器械生物安全柜,CO2培养箱,6孔培养板T25培养瓶

四、试剂:

1 MSC NutriStem? XF Medium

品牌

货号

名称

规格

保存条件

Biological

Industries

05-200-1A

MSC NutriStem? XF Basal Medium

MSC无血清基础培养基

500ml

4

Biological

Industries

05-201-1U

MSC NutriStem? XF Supplement

MSC无血清添加剂

3ml

-20

Biological Industries

05-752-1F

MSC Attachment solution (100X)           MSC贴壁试剂

1 ml

4

建议选用试剂

Biological Industries

03-079-1B

Recombinant Trypsin-EDTA Solution重组胰酶-EDTA

100ml

-20

Biological Industries

03-048-1C

Soybean Trypsin Inhibitor (50X)

大豆胰酶抑制剂

20 ml

-20

Biological Industries

05-712-1D

MSC Freezing Solution

MSC 冻存液

10 ml

4

Biological Industries

02-023-1A

DPBS (w/o Ca & Mg)

DPBS缓冲液

500 ml

RT

Biological Industries

03-031-1B

Penicillin-Streptomycin Solution(100X) 青链双抗

100ml

-20

五、实验前准备:

5.1  完全培养基的准备

5.1.1  冻存的MSC NutriStem? XF Supplement在室温或2-8℃解冻,避免反复冻融。

5.1.2  配制:MSC NutriStem? XF Basal Medium(培养基)MSC NutriStem?XF Supplement(添加物):青链双抗=500ml:3ml:5ml,4保存,2周内使用。

1:双抗非必须,建议原代(P0)时使用。

2:培养基含L-Glutamine贮藏时避免长期照光。

 

5.2  包被培养皿

5.2.1  使用DPBS溶液(货号:02-023-1A),将MSC贴壁试剂稀释100倍(1:100)。

5.2.2  参照表3,加入适量的1X MSC贴壁试剂涂层培养或板

3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量

培养器皿

表面积cm2/孔或瓶

1X   MSC贴壁试剂使用体积

96孔板

 0.34

0.05~0.1   ml

24孔板

1.9

0.2~0.4   ml

12孔板

3.9

0.4~0.8   ml

6孔板/ 35 cm培养皿

9.6

1~2   ml

T25瓶/ 60 cm培养皿

25

2.5~5   ml

T75

75

7.5~15 ml

1:涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存,需在一周内使用。标示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)  2包被期间, 注意包被液不可以干掉!

5.2.3  轻轻摇动培养皿,确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后,用封口膜包裹涂层的培养皿。

5.2.4  2-8℃孵育过夜;或者在CO2培养箱37至少孵育30分钟

5.2.5  接种前, 吸除贴壁试剂,再用DPBS轻轻冲洗培养皿,即可接种细胞。

 

5.3  制备1X大豆胰酶抑制剂

5.3.1 使用无菌的DPBS,将50X大豆胰酶抑制剂(03-048-1C)稀释成1X。

 

六、使用范例

6.1  UC-MSC原代培养

6.1.1  无菌条件下取新鲜脐带,用DPBS漂洗净血迹 (如怀疑污染,可先在75%医用酒精中浸泡 2min)

6.1.2  250px 培养皿中,剪成1~50px脐段,剔除血管,用DPBS洗净血迹,再剪成1mm3组织块。( 1)

6.1.3  用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

6.1.4  37℃5% CO2培养箱孵育 30min以使组织块粘贴在培养皿壁上。

6.1.5  向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加勿使冲动组织块)

6.1.6  375% CO2 培养箱孵育过夜次日 (D1) 每孔再补加1ml 完全培养基。

6.1.7  375% CO继续培养5 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞,但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)

6.1.8  再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出) (2、图3)

6.1.9  2天换一次培养液,继续培养2~4天,待细胞融合度(Confluency)达到约80%后传代培养 (4)

注1:组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁,换液动作要尽可能轻微,避免冲动组织块。培养基加量不能太多,以免组织块漂浮。

注2为增加成功率,从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加2.5%的人AB 血清 (AB 型血清必须除菌过滤,且 HbsAG HCV/HIV 抗体阴性)

 

6.2  UC-MSC传代培养与冻存

6.2.1  待细胞融和度达到约80%后进行传代(细胞不能太密集,否则容易分化),吸弃传代板孔中的培养基,每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。

6.2.2  根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA (货号:03-079-1B,T25建议使用1ml),在37℃,5% CO2 培养箱作用 3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落)。

6.2.3  显微镜下观察细胞完全脱落后, 根据重组胰酶-EDTA使用量加入10倍体积的大豆胰酶抑制剂(1X)300-400 xg离心3~5min例:用1ml重组胰酶-EDTA,则加入10ml大豆胰酶抑制剂(1X)与细胞混和均匀再离心

6.2.4  谨慎吸出上清,细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后,混匀细胞悬液。

6.2.5  按照所需的比例进行传代或按照5000-6000 cells/cm2的细胞密度将细胞接种至培养器皿中,放入37℃, 5% CO2培养箱内培养。

6.2.6  每2-3天更换一次培养基,待细胞融合度达到80%左右时,参照操作步骤6.2.1~6.2.5做细胞传代; 或者参照操作步骤6.2.1~6.2.3收获细胞冻存。

6.2.7  细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×10cells/ml) MSC 冻存液(货号:05-712-1D)中,装入冻存管,2~8℃冰箱放置30min,-80℃冰箱放置 24h,转入液氮罐冻存。     

:本方法仅供参考,用户可根据自身经验做合理调整。

 

附图:

10892915_111.png






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