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商品编号:49659
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韩国iNtRON 核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

价    格:询价

产    地:韩国更新时间:2019/7/15 13:41:34

品    牌:iNtRON型    号:

状    态:正常点击量:2109

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一、描述
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白,提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
 
二、试剂盒组份

组份
CY10022a(50 test)
CY10022a (100 test)
Buffer A
 25 mL
25 mL ×2
Buffer B
 1.5 mL
3.0 mL
Buffer C
12.5 mL
25 mL
DTT
50μL
100μL
蛋白酶抑制剂
250μL
500μL
PMSF(MW:170.3)
1.0mg
2.0mg
异丙醇
800μL
1.5mL

 
三、操作步骤
1、   取培养细胞5×106~1×107个/mL,弃去培养液,细胞用预冷的PBS洗涤两遍;
2、   用1mL预冷的PBS刮下细胞转移至预冷的1.5mL 微量离心管中;
3、   4℃离心,500×g,3 min收集细胞,用移液枪尽可能取去上清,勿留残液,估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积); 【如果是组织样本,将组织剪切成小块,加入适量的冰冷PBS均浆后,静置5 min ,小心吸取上清转移至另一离心管中,弃沉淀,上清4℃离心500×g,3 min,弃上清,估计细胞压积】。
4、   每20μL细胞压积中,加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT,5μL PMSF(用户自配:浓度100mM,溶于异丙醇),5μL蛋白酶抑制剂】,最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上10~15min;
5、   加入11μL冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min;
6、   再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后, 4℃离心,16000×g,5min;
7、   尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞质蛋白;
8、   在离心沉淀物(细胞核)中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT,5μLPMSF,5μL蛋白酶抑制剂),最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds;
9、   4℃离心,16000×g,,10min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白;
10、上述提取的胞质蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法),分装并保存于-80℃,避免反复冻融。
 
四、备注 
1、  所有的试剂及器具均需预冷后使用;
2、  细胞的数量不应少于2~5×107个/mL;,
    3、  以上各缓冲液的使用量是以20μL细胞压积为例,如细胞压积不同,请参考下表加入各缓冲液。

细胞压积PCV
Buffer A
Buffer B
Buffer C
10μL
100μL
5.5μL
50μL
20μL
200μL
11μL
100μL
50μL
500μL
27.5μL
250μL
100μL
1mL
55μL
500μL

    4、  一般常规提取的蛋白样品,进行后续试验不需要透析,但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想,则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐,建议使用凯基透析Buffer (Cat: KGB—P001)透析后进行后续分析。

五、储存 -200C,保存一年。





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