酵母质粒DNA小量提取试剂盒(50次)
产品用途
PCR扩增
转化
质量控制
从酵母提取pBI121质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。
酵母质粒DNA提取流程图
图1 酵母质粒DNA纯化流程图
操作方法
1 取酵母细胞液1-5 ml(最多不超过5×107个)。12,000离心1min,尽量去除上清。
2 向菌体中加入300 μl 山梨醇缓冲液和50 U溶壁酶,漩涡振荡直至菌体完全悬浮。在摇床上220 rpm/min,30℃处理1 小时。
注:根据酵母菌株和数量的不同,所用溶壁酶用量和孵育时间应该进行适当调整。
3 5,000 rpm离心10min,去上清,收集沉淀。
4 加入250 μl溶液YⅠ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置1-2min。
注:初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。
不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否将决定质粒DNA的得率。
室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。
5 加入250 μl溶液YⅡ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。
注:若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
加入溶液Ⅱ后,不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。此时菌液应变得清亮粘稠,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
6 加入350 μl溶液YⅢ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。
注:加入溶液Ⅲ后,应立即混匀避免产生局部沉淀。
7 12,000 rpm室温离心10min,收集上清。
8 将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2min。
注:如果收集的上清液过多,超过DNA纯化柱容积(15 ml),可将上清分次加入DNA纯化柱中
9 12,000 rpm 离心1min,弃滤液。
注:此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
10 加入500 μl 溶液PB。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。
注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。
11 加入500 μl溶液W。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。
注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。
12 加入500 μl溶液W。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。
13 12,000 rpm离心3min,以去除纯化柱中残留的液体。
注:此步骤的作用是去除残余酒精,避免降低质粒的生物学活性,影像下游酶促反应。
14 将 DNA 纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,滴加50-100 μl溶液Eluent,室温放置2min。12,000 rpm离心1min,管底即为高纯度酵母质粒
DNA。酵母质粒DNA置于-20℃保存。
注:溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5,加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。对溶液Eluent 60℃预热,会提高提取酵母质粒DNA的产
量。