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商品编号:53882
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无内毒素快速质粒大量提取试剂盒(10preps)

价    格:1050.00

产    地:美国更新时间:2019/7/15 13:41:34

品    牌:Biomiga型    号:PD1520-01

状    态:正常点击量:1030

15068328216
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上海妙骏生物科技有限公司

联 系 人:言国英

电     话:021-54461558

传     真:021-54461657

等     级: (第 10年)

性     质:生产型,

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产品组成

Catalog #

PD1520-00

PD1520-01

PD1520-02

Preps

2

10

25

ezBindTM Columns

2

10

25

Buffer A1

22 mL

110 mL

270 mL

Buffer B1

22 mL

110 mL

270 mL

Buffer N3

8 mL

40 mL

85 mL

Buffer KB

22 mL

110 mL

270 mL

Buffer RET

22 mL

110 mL

270 mL

RNase A(20 mg/mL)

2.2 mg

(110 μL)

11 mg

(550 μL)

27 mg

(1.35 mL)

Endofree Elution Buffer

5 mL

25 mL

60 mL

User Manual

1

1

1

实验前准备
 
RNase A:室温下可稳定保存半年,使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
 
Buffer B1:在低于室温时会沉淀,请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解,溶液澄清,使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。
 
准备70%和100%的乙醇。
 
在室温下(22-25oC)进行所有离心操作。
 
 注意事项
 
质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇,相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer.
转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。
切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
柱结合能力:1 mg
对富含内源核酸酶的宿主菌(endA)如HB101, JM101, TG1等,需去核酸酶,请使用产品PD1713。
 
 
操作步骤

1.   取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL (勿超过 200 mL)的LB培养基(含适量抗生素),37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。注:残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分,离心后沉淀较松,不能有效吸取上清。注:本说明书中的操作程序适用于标准LB (Luria Bertani)培养基培养12-16 小时后,OD600(细菌密度)在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基,例如TB 或2×YT,请注意保证OD600不超过3.0。

2.   加入10 mL Buffer A1(确保已加入RNase A),用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。 注:不完全悬浮易导致菌体裂解不完全,从而使产量降低。

3.   加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。  注:切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟,时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清,则表明菌体裂解不充分,应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。

4.   加入3 mL Buffer N3, 立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。

5.   将离心管转至高速离心机,在室温下12,000 x g离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)。注:低温下RNase不工作,易有RNA污染。如果离心机转子较冷,将离心管在室温下温育10分钟后再离心。若无告速离心机,可用Syringe filter替代(在PD1522中提供,也可单独购买)。

6.   转移上清液20 mL(不超过20 mL)至新的50mL离心管中,加入0.5倍体积的Buffer RET (即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET) 及10 mL的100% ethonal,用手用力甩5次以混匀,需马上离心过DNA柱。

7.   立即转移20 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中,室温下> 2,500 x g离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中,室温下> 2,500 x g离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。注:如果50 mL的收集管与离心机转子不符,可在台式离心机> 2,500 x g 离心2分钟。

8.   可选:向离心柱中加入10 mL Buffer KB,室温下> 2,500 x g离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。

9.   向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇,室温下> 2,500 x g离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。

10.将离心柱放回高速离心机中,室温下5,000 x g开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。注:此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇,乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。若转速低于5,000 x g,需离心20分钟,并可放在空气中晾干。

11.将离心柱转至一个新的50 mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer,室温放置1分钟,> 2,500 x g离心5分钟,以洗脱质粒DNA。将50 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟,> 2,500 x g离心5分钟。 两次洗脱将提高得率。注:提取到的质粒DNA可用于转染内毒素敏感性细胞株,原代细胞及用于微注射,建议去除内毒素。

 





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