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商品编号:53862
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无内毒素质粒大量提取试剂盒(25preps)

价    格:2160.00

产    地:美国更新时间:2019/7/15 13:41:34

品    牌:Biomiga型    号:PD1514-02

状    态:正常点击量:866

15068328216
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上海妙骏生物科技有限公司

联 系 人:言国英

电     话:021-54461558

传     真:021-54461657

等     级: (第 10年)

性     质:生产型,

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试剂盒组分:
 
Catalog #
PD1514-02
Preps
25
ezBindTM Columns
25
Buffer A1
270 mL
Buffer B1
270 mL
Buffer N3
400 mL
Buffer KB
270 mL
RNase A(20 mg/mL)
27 mg(1.35 µL)
EndoClean Buffer
60 mL
Endofree Elution Buffer
60 mL
User Manual
1
 
保存条件:
 
RNAse A在4℃下可以保存一年,Buffer A1加入RNase A 后4℃保存,其它组分室温保存。
 
注意事项:
  1. 质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇,相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer。
  2. 转化菌: 若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
  3. 柱结合能力:1 mg
  4. 对富含内源核酸酶的宿主菌(endA+)如HB101, JM101, TG1等,需去核酸酶,请使用产品PD1713。
操作简明步骤:
  1. 取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL (勿超过 200 mL)的LB培养基(含适量抗生素),37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
  2. 加入10 mL Buffer A1(确保已加入RNase A),用移液器或涡流震荡确保菌体充分悬浮。
  3. 加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 
  4. 加入2 mL Buffer N3, 立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
  5. 将离心管转至高速离心机,在室温下12,000 x g离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)。
  6. 定量吸取离心后的上清液至新的50 mL管中(避免吸起沉淀),加入0.1 volume的EndoClean Buffer,混匀后冰浴10分钟,其间不时摇匀(若EndoClean Buffer粘稠难吸,可将枪头剪掉头后再吸取)。
  7. 取出后65oC温浴5分钟,室温下(务必使溶液温度恢复到23oC以上,否则溶液不分层)12,000 x g离心10分钟(也可在2,500 x g离心15分钟)。此时溶液分为两层,上层水相含有质粒,下层红色有机相含有内毒素。
  8. 将上层水相转移至一个新的50 mL管中,加入10 mL的Buffer N3及12 mL的100% ethonal,用手用力甩5次以混匀,需马上离心过DNA柱。
  9. 立即将20 mL裂解液/乙醇混合液转移至带收集管的DNA柱中,室温下> 2,500 x g离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中,室温下> 2,500 x g离心5分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。
  10. 可选: 向DNA柱中加入 10 mL Buffer KB, 室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
  11. 向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇,室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“11”。
  12. 将离心柱放回高速离心机中,室温下> 2,500 x g开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。
  13. 将离心柱转至一个新的50 mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5-1 mL的Endofree Elution Buffer,室温放置1分钟,5,000 x g 离心5分钟,以洗脱质粒DNA。若想提高得率,将50 mL离心管中的洗脱液再加到柱的中间,5,000 x g离心5分钟以洗脱质粒DNA。




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