海洋动物血液基因组DNA提取试剂盒(50次)
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。
保存条件
蛋白酶K于-20℃保存。
其余试剂置于室温(15-25℃)干燥条件下保存1年。
如果消化缓冲液DS和MS中沉淀,可在55℃加热溶解,待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA的纯化效率。
操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
预备实验:
取血液/体液样本在红细胞计数板进行细胞计数,计算其细胞数量级10x/ml,(7-x)ml就是提取基因组DNA所需的血液体积数。
1 取血液/体液样本(7-x)ml加入到一只1.5 ml离心管中,5,000 rpm离心3min,弃上清,收集沉淀。
● 如果样本超过1.5ml,可分次加入,离心收集沉淀,务必使离心所得的沉淀中包含105-106的细胞数。
2 加入200靗消化缓冲液DS,旋涡振荡直至完全分散。
● 如需去除RNA,加入消化缓冲液DS后,再加入4靗 RNase A(100 mg/ml)溶液,震荡混匀,室温放置5min。
3 加入20靗蛋白酶K和220靗裂解液MS,漩涡振荡混匀。65℃温浴10min。溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
● 加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,
● 可能导致提取DNA量少和提取出的DNA 纯度降低。
4 加入220靗无水乙醇,上下来回颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀,将溶液及絮状沉全部淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
5 加入500靗去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗脱,以获得高质量基因组DNA。
6 加入500靗漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
7 加入500靗漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
8 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
● 此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
9 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加30-100靗纯化液TE。室温放置2min。
10 12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。
● 纯化液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
● 对纯化液TE 进行60℃预热,会提高基因组DNA的产量。