Quick血液基因组DNA提取试剂盒(50次)
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。
Quick血液基因组DNA提取流程图
图1 Quick血液基因组DNA纯化流程图
操作方法
1 取全血样品,每220 μl加入到一只1.5 ml离心管内。如果不足220 μl可用缓冲液DS补足。
注:对于哺乳动物全血,每200 μl全血中可提取1.5-5 μg的基因组DNA。如从鸟类、两栖类或更低级的动物血液中提取基因组DNA,因其血液中红细胞有细胞核,血液用量勿超
过20 μl/离心管。每20 μl全血中可提取40 μg的基因组DNA。
如需要去除RNA,可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液,震荡混匀,室温放置5min。
2 加入20 μl蛋白酶K和220 μl裂解液QS。 65℃温浴10-15min。溶液应呈黑色。简短离心以去除管盖内壁的水珠。
3 加入220 μl无水乙醇,上下来回颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀,将溶液及絮状沉全部淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
4 加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:此步骤的作用是去除硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质,以获得高质量基因组DNA。
5 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
6 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
7 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
注:此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
8 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加30-100 μl纯化液TE。室温放置2min。
9 12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度血液基因组DNA。-20℃保存。
注:洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。对洗脱液TE 60℃预热,会提高基因组DNA的产量。
图2 血液基因组DNA电泳图
注意事项
1 柠檬酸、EDTA和肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素队酶促反应有可能起阻害作用。采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。
2 基因组DNA的得率,会因抗凝剂的种类以及血液保存条件的不同而各异。
3 基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化液TE。用无菌的离心管分装后保存于-20℃或-80℃。
基因组DNA的浓度及纯度检测
1 基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯
度。
2 DNA 应在OD260 处有显著吸收峰, OD260 值为1 相当于大约50 μg/ml 双链
DNA、40 μg/ml 单链DNA。
3 OD260/OD280 比值应为1.7–1.9,如果洗脱时不使用纯化液TE,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。