基因组DNA快速提取试剂盒(50次)
产品用途
常规限制性酶切
PCR扩增
文库构建
Southern 杂交
分子标记分析
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。
基因组DNA提取流程图
图1 基因组DNA纯化流程图
操作方法
1 取少量样本材料,放入液氮预冷的研钵中。快速用力研磨的同时加入少量液氮,直至样本材料被研磨成粉末。将研磨好的样本转移至1.5 ml离心管中,
每管组织材料含量应不超过10 mg。
注:如没有液氮。可用用剪刀剪成小块,放入研钵或匀浆器中,加入适量TE(pH 8.0),处理成细胞悬液。将不超过10 mg当量的细胞悬液转移至一个新的1.5 ml的离
心管中,12,000 rpm离心1min,弃上清,收集沉淀。
每支离心管中的样本当量不宜超过10 mg。每10 mg样本材料可获得10 μg基因组DNA。样本量过大,将会影响细胞核裂解效率并可能堵塞纯化柱,进而降低基因组
DNA的得率与纯度。
2 加入200 μl消化缓冲液DS,漩涡振荡至形成完全均一的悬浮液。
注:如需去除RNA,可加入4 μl RNase A(100 mg/ml),振荡15秒,室温放置5min。
3 加入20 μl蛋白酶K和220 μl裂解液MS,漩涡振荡混匀。65℃温浴10min。溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注:加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的
DNA 不纯。
如果是比较致密难裂解的组织,可先加蛋白酶K混匀后,55℃温浴至完全溶解。再加MS混匀,65℃温浴10min。
4 加入220 μl无水乙醇,上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000rpm离心
1min,弃滤液。
注:此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
5 加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:此步骤的作用是去除硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质,以获得高质量基因组DNA。
6 加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
7 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
8 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
注:此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
9 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。
10 12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。
注:洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
对洗脱液TE 60℃预热,会提高基因组DNA的产量。
注意事项
1 应尽量使用新鲜的实验材料,确保提取的基因组DNA不被降解。不能立刻提取基因组DNA 的实验材料应尽快置于液氮或-70℃冰箱中保存并避免反复
冻融。
2 使用液氮研磨组织材料时,应随时加入液氮,确保提取的基因组DNA不被降解。
3 基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化液TE。分装后保存于-20℃或-80℃。
基因组DNA的浓度及纯度检测
1 基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
2 DNA 应在OD260 处有显著吸收峰,OD260 值为1 相当于大约50μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。
3 OD260/280比值应为1.7–1.9,如果洗脱时不使用纯化液TE,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。