血液基因组DNA大量提取试剂盒(10次)
产品用途
常规限制性酶切
PCR扩增
文库构建
Southern杂交
分子标记分析
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。
保存条件
蛋白酶K于-20℃保存。
其余试剂置于室温(15-25℃)干燥条件下保存1年。
如果消化缓冲液DS和MS中沉淀,可在55℃加热溶解,待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA的纯化效率。
操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1 取血液样本,每5-10 ml血液加入到一只50 ml离心管中。加入2倍体积的红细胞裂解液RS。漩涡振荡或上下来回颠倒混匀。5,000 rpm离心3min,弃上清,
收集白色或淡红色沉淀,重复上诉步骤。
● 如沉淀仍然呈深红色,表明红细胞裂解不充分,可再加等体积红细胞裂解液RS处理一次。
● 对于哺乳动物全血,每5-10 ml全血中可提取30-200 μg的基因组DNA。如从鸟类、两栖类或更低级的动物血液中提取基因组DNA,因其血液中红细胞有细胞核,血液用量勿超过
500 μl/离心管。每500 μl全血中可提取200 μg的基因组DNA。
2 加入5 ml消化缓冲液DS,漩涡振荡至形成完全均一的悬浮液。
● 如需去除RNA,可加入100 μl RNase A(100 mg/ml),振荡15秒,室温放置5min。
3 加入500 μl蛋白酶K和5.5 ml裂解液MS,漩涡振荡混匀。65℃温浴15 min。溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
● 加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA 不纯。
4 加入5.5 ml无水乙醇,上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000rpm离心
1min,弃滤液。
● 此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
5 加入10 ml去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 此步骤的作用是去除硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质,以获得高质量基因组DNA。
6 加入10 ml漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
7 加入10 ml漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
8 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
● 此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
9 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。
10 12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。
● 洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。
● 对洗脱液TE 60℃预热,会提高基因组DNA的产量。
注意事项
柠檬酸、EDTA和肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶促反应有可能起抑制作用。采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。
基因组DNA的得率,会因抗凝剂的种类以及血液保存条件的不同而各异。
基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化液TE。用无菌的离心管分装后保存于-20℃或-80℃。