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Izon公司纳米粒度检测技术

苏州达麦迪生物医学科技有限公司2019年2月11日 11:50 点击:2571

默瑞生物是美国Izon公司的中国授权总代理商,欢迎大家咨询订货。
  默瑞热线:4006-400-850
  售前咨询:info@moreybio.com
  产品订购:order@moreybio.com
  售后支持:tech@moreybio.com
  默瑞官网:www.moreybio.com  
Izon qEV 柱从生物样品中分离细胞外囊泡。

  适用于 qEV 的样品 1

  • 血清

  • 血浆

  • 唾液

  • 尿

  • 细胞培养液

  选用 Izon qEV 柱的优势包括 2

  • ~15 分钟的分离时间

  • 极大程度地降低蛋白复合物产生和囊泡聚集的风险

  • 可以使用生理等渗的缓冲溶液

  • 是一种温和、快速的方法,可以最大程度地维持囊泡的生物学功能

  • 囊泡回收率为 50%或更高

  • 蛋白的去除比>1000 倍

  • HDL 纯化>8 倍

  说明书

  样品体积 ≤1 mL, 500 μL 为获得最高纯度 EV 的优化体积

  空隙体积 3.0 mL ± 0.25 mL

  操作温度 15 至 25 °C

  流速 在 18°C 时通常为 0.8 至 1.2 mL/min

  分离尺寸 70 nm

  缓冲液 PBS

  床层体积 10 mL

  最大可通过尺寸 1 μm

  顶部和底部过滤尺寸 20 μm

  纯化 pH 范围 3-13

  清洗 pH 范围(CIP) 2-14

  保质期 3 个月(适当保存)

  第一次使用后的寿命 取决于使用方法与保存方法

  1 注意有些“原始”样品未经处理不得直接用于 qEV 柱或 TRPS 分析,需要进行至少两次样品离心(例如血、唾液)或浓缩(细胞培养液)。从 Contact support@izon.com 获得有关操作步骤的帮助。

  2 A.N Böing et-al; “Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography”, Journal of Extracellular Vesicles 2014, 3: 23430

  1

  qEV 技术手册 WWW.IZON.COM

  安全预防

  • 当使用 qEV 柱时采取适当的个人防护措施,比如实验服,手套和防护镜。

 

  如下图所示:

  • 将柱子固定,使液面水平(确保柱子垂直)

  • 不要移除底部滑动盖

  • 小心缓慢地移去顶盖

  

 

  3qEV 尺寸排阻柱只用于研究目的。

  April 2016

  柱子的平衡

  • 移除底部滑动盖,并且使用至少 10 mL 洗脱缓冲液(PBS)冲洗柱子。如果不是使用 PBS 洗脱,那么至少使用 30 mL 洗脱缓冲液冲洗柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间,这可用于判断何时需要清洗柱子。

  • 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

  • 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

  • 使用当天新配的过滤(0.2 μm)缓冲液避免引入颗粒物污染。

  • 为了最好的结果,建议购买 Izon Prep and Reagent 试剂盒。

  • 如果在操作温度范围之外使用,可能会得到错误的结果。

  样品的纯化

  1.样品的引入的应用

  1. 在柱子移除底部滑动盖之前,用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

  2. 加入 500 μL 样品。

  3. 立即移去底部滑动盖。

  4. 立即开始收集 0.5 mL 馏分;

  • 最开始的六个馏分(3.0 mL)是空隙体积,不包含囊泡,通常无需分析。

  • 建议将空隙体积收集在同一个收集管中

  来节约时间,并可避免 6 个单独的管子带来的测量误差。

  5. 当最后的样品刚刚进入柱子顶部筛板(与之相平),加入更多的缓冲液,但是不要高于顶部筛板 2 mL。

  • 等待直到最后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板,避免样品稀释。

  2. 样品馏分收集

  当依据操作流程使用 qEV 柱时,EVs 大多数洗脱于馏分 7、8 和 9 中,去除了~99.8 %的蛋白;

  2

  qEV 技术手册 WWW.IZON.COM

  大于 10 的馏分包含更多的蛋白和更少的囊泡,不建议分析。为了得到更高的 EV 回收率,馏分可以合并起来,但是,合并馏分会稀释 EVs 的浓度。

  方法 A — 得到最高的纯度和浓度不同的样品会得到不同的洗脱峰形,因此建议

  预先测量 EV 浓度并对所有馏分(7 - 11)进行蛋白纯化。

  1. 空隙体积之后立即收集 3 个囊泡馏分,每个馏分 500 μL(馏分 7、8 和 9)。

  2. 测量每个馏分的 EV 浓度(使用 Izon qNano)和蛋白纯度。

  • 为了得到高浓度囊泡,使用最高 EV 浓度的馏分(通常 7 和 8)。注意:合并馏分会稀释 EV 浓度。

  • 为了得到高纯度囊泡,使用最低蛋白浓度的馏分。

  方法 B — 一般使用操作空隙体积之后立即收集一个囊泡馏分,1500

  μL。为了减少蛋白污染,建议只收集 1000 μL。

  3. 囊泡收集后

  当收集完囊泡馏分之后,用至少 10 mL 缓冲液冲洗柱子,并按照《保存》部分的要求保存柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸流过尺寸排阻柱所需要的时间,这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。

  qEV 柱的维护

  再次使用

  如何检测柱子何时被污染并需要清洁;

  • 流速相比初始流速开始变缓。因此建议测量初始冲洗流速(和/或空隙体积)作为对比。

  April 2016

  • 如果较先前相似的样品来说回收率明显下

  降,那么期望的 EVs 产率也相应下降。如果是这样,使用 Izon CPC100 校正颗粒(稀释于 PBS 缓冲溶液中),收集馏分并使用 qNano 测量至少 2000 个数。两个峰值馏分的回收率应该>50%。

  • 在冲洗完后,柱子顶端有颜色的变化。

  注意

  • 对于新的柱子和干净或再生的柱子,顶盖和凝胶表面之间的空间说明储存过程当中凝胶有所沉降,并不影响其性能。为了使样品的稀释影响最小化,可以将顶盖向下推动<2 mm。

  • 当囊泡馏分随后被用于 PCR 或 RT-PCR 时,建议柱子单次使用。

  柱子的再生

  通常使用 20 到 30 mL 缓冲液清洗柱子,随后使用新缓冲液平衡柱子(如果更换环境)。

  在一些应用中,变性的蛋白或脂质不会在再生步骤中被洗脱下来。可以通过下面的清洗步骤来去除。

  柱子的清洗

  去除沉淀蛋白、非特异性吸附蛋白和脂蛋白

  用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子,然后用至少 30

  到 50 mL 缓冲液冲洗柱子,并检查洗脱溶液

  pH。

  去除强非特异性吸附蛋白、脂蛋白和脂质

  用 20 mL 非离子型表面活性剂溶液,如 0.1 %

  Triton X-100 清洗柱子,然后用至少 20 到 30

  mL 缓冲液冲洗柱子。

  3

  在某些情况下,一些样品仍会残留痕量蛋白。在清洗结束时再次检查蛋白含量,如果蛋白水平高于预期,再清洗一次。

  柱子的消毒

  消毒可以最大程度减少凝胶的微生物污染。用

  10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 到 50 mL 无菌缓冲液平衡柱子,并检查洗脱溶液

  pH。

  注意

  • 脱气缓冲液有助于避免凝胶基质中气泡的

  产生。少量的气泡(<10)对柱效影响极小。

  • 建议使用 0.15 M 或更高离子强度的缓冲液,以避免溶质与凝胶基质之间产生不必要的离子相互作用。

  • 为了避免尺寸排阻柱的堵塞,建议过滤或低速离心生物样品以去除大颗粒物。

  普通 EV 来源的样品准备步骤

  普通 EV 样品的应用手册和操作步骤见www.izon.com。如果不确定如何准备样品,请

  联系技术支持 support@izon.com。

  柱子的性能指标

  囊泡的峰值洗脱

  • 对于 500 μL 的样品体积,囊泡的洗脱峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

  • 两个峰值馏分的回收率大约 50 %。

  • 对于 500 μL 的样品,峰值馏分通常在馏分 8 和 9 之中。如果希望更高的纯度,可以只收集最早的峰值馏分。

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  通过测定 280 nm 处的紫外吸收可以得到 qEV 柱的蛋白洗脱图。通过 Bradford 法可以准确测定每个馏分中蛋白的精确含量。图 1 展示了当 500 μL 血浆样品上样至柱上时的囊泡洗脱图。每个馏分的囊泡浓度通过 qNano 测量,蛋白含量通过 280 nm 处的吸收值来测量。

  

 

  图 1. 典型的 qEV 柱的洗脱图;蛋白洗脱的馏分晚于囊泡洗脱的馏分。

  囊泡的富集是十分明显,它们主要存在于馏分7、8 和 9 中。血清蛋白的洗脱更慢一些,主要存在于馏分 11 - 30 中。大于 10 的馏分通常含有高浓度的蛋白和低浓度的囊泡,不建议用来做分析。

  EVs 的洗脱始于馏分 7,馏分 8 和 9 的浓度达到最高。收集越多的馏分,EVs 的总回收率越高。

  图 2 血浆中 EVs 的回收率说明了这点。但是,收集的馏分越多,EV 的回收浓度就会越稀释。见表 1。

  4

  

 

  图 2. 用 CD61 生物标志物测量的累积 Evs 回收率。误差条表示标准偏差。

  上样体积

  上样体积越大,囊泡馏分中的囊泡纯度越低。图 3 展示了血清上样体积为 100 μL,500 μL 和 2000 μL 时的囊泡分布。2000 μL 的样品导致囊泡最大程度地被蛋白污染。2000 μL 样品中外泌体的出峰延迟显而易见。

  

 

  图 3. 血清上样 100 μL 至 2000 μL 的囊泡洗脱图。

  为了得到更纯的 qEV,建议最佳的样品体积为 100 μL 至 500 μL,这样囊泡会洗脱于馏分 7 至 9 之中。

  图 4 展示了血清上样体积为 100 μL 和 500 μL 时的囊泡洗脱图。

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  图 4. 血清上样为 100 uL 和 500 μL 时的囊泡洗脱图。囊泡的尺寸分布为 70− 300 nm。

  囊泡的损失发生在当样品体积大于 500 μL 时,囊泡的洗脱峰很宽以至于一些囊泡从馏分 11 中被洗脱下来。这些馏分不建议用来分析因为包含了大量的干扰蛋白。

  纯化

  图 5 展示了馏分 7 到 9 之间含有很少量的蛋白,且越后面的馏分中蛋白含量越多。

  

 

  图 5. 馏分中蛋白含量占起始蛋白含量的百分比,误差条是七个柱子中测量蛋白含量的标准偏差。

  图 6 展示了经过 qEV 柱纯化后,EVs 相对于蛋白的纯化度。每个馏分的纯化因子(纯化前后蛋白的减少比例)如图所示。馏分 7 和 8 富集

  的 EVs 最多,也就是相对于回收的囊泡来说大部分蛋白被除去。


(来源: 苏州达麦迪生物医学科技有限公司


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