来宝网Logo

热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

现在位置首页>技术资料首页>实验技术>生物技术>话说CRISPR技术的利与弊

话说CRISPR技术的利与弊

北京百奥赛图基因生物技术有限公司2017年8月15日 15:58 点击:17067

话说CRISPR技术的利与弊

2017-08-15 韩英英 百奥赛图

      说到基因编辑,大家都会想起CRISPR技术。这个当年名声大噪的技术,现今依旧热度不减,尤其是我们的CRISPR大神张锋,近期发表的文章频频亮相于知名杂志,又引起一片热议。时过境迁,CRISPR技术并没有销声匿迹,一直在线。但任何事物包括技术有利就有弊,CRISPR技术当然也毫不例外。



CRISPR技术就是这么好用!

CRISPR-Cas9.jpg

       火了四年之久的技术,耳熟能详的优势显而易见:摒弃了对于ES细胞的依赖,CRISPR技术实现了对大鼠、猪、猴、斑马鱼等多种物种的编辑;CRISPR技术依赖于Cas9和sgRNA实现“精准”切割,简化实验步骤,大大缩短实验周期。周期短、工作量小,随之而来的就是费用的降。综上,性价比高的技术当然当仁不让的会一直火。



CRISPR技术也有缺点?

捕获.JPG

       CRISPR技术自问世以来,被应用至世界各地众多实验室中进行科学研究,在享受其优势的同时,它的弊端也是众所周知:sgRNA与Cas9蛋白这哥俩,并不是时时刻刻都兢兢业业工作的,谁还没有倦怠的时候呢?本应该精准定位的sgRNA也有走眼的时候,本应该识别标准PAM序列 的Cas9蛋白,也偶尔不走心,结果就是脱靶,影响了编辑的效率。



有“病”不可怕,关键是“对症下药”?

       医生治病讲究对症下药,科研思路也不例外。找出原因解决问题,既然是sgRNA和Cas9蛋白出现了毛病,那么我们就针对不同病症采取不同方式:

timg (1).jpg

优化sgRNA

(1)改变自我:改变sgRNA 的长度,截断5' 端的2-3 个碱基或在识别序列前加2 个鸟嘌呤,切割活性不变, 脱靶率降低5000 倍。

(2)提升自我:增加sgRNA 的稳定性。如在gRNA 中增加一对A-U 碱基配对等方法。此外, 有研究表明Cas9 直系同源酶对某些位点的特异性较SpCas9 高,这无疑为提高特异性提供了一条新思路。

提高Cas9蛋白自身特异性

       专一性对于家庭是很重要,而对于CRISPR技术也是很重要。专一性一方面与自身有关,另一方面也与环境的诱惑有关,因此对于Cas9蛋白,我们要从内和外两个因素去考虑。

(1) 擦亮眼睛,辨认出谁是你的Mr/Mrs Right:增强Cas9 蛋白对标准PAM 序列的识别能力,突变体D1135E对标准PAM 的识别更加特异,从而降低因识别非标准PAM 序列而引起脱靶。

(2)与对的人相亲相爱就好,不要老是沾花惹草:将Cas9蛋白进行定点突变形成eSpCas9和SpCas9-HF1,突变体减弱了Cas9 蛋白与DNA 的非特异性结合的能力,增强靶向序列与Cas9 蛋白结合的竞争力。

(3)减少外界诱惑:调控Cas9 蛋白在细胞中的表达量。通过使用诱导型启动子、插入4-HT 依赖的内含肽等方法构建诱导型Cas9 蛋白,减少基因组暴露于Cas9 与sgRNA 复合体的时间, 即减少Cas9 与非靶向序列的结合概率,进而降低脱靶率。

(4)断舍离:仅保留其核酸识别能力,断除其核酸内切酶的活性。当然对于自身也是必须的:降低HNH 或RuvC 结构域功能的突变体H840A 和D10A;构建使Cas9 蛋白丧失核酸内切酶活性,借助其他核酸内切酶实现基因编辑的CRISPRi和FokⅠ-dCas9



百奥赛图杀手锏——Southern blot检测金标准

sgRNA设计严谨

舍弃可能脱靶到有功能基因组序列的sgRNA

纯RNA注射

缩短Cas9蛋白和sgRNA的作用时间

Southern blot检测

        对大量数据统计数据分析发现,采用ES细胞方式制备,随机插入概率约为20%,采用CRISPR/Cas9技术,大约有32%的概率有随机插入。而这32%中有14%的随机插入无法依靠交配传代去除,排除随机插入的金标准是Southern blot百奥赛图严把质量关,坚持进行Southern blot检测,确保基因编辑获得的动物无随机插入。

e9ba807f-d245-448f-948a-270430c3b5e3(1).png

      Southern杂交的目的是为了检测目的基因的插入位置及拷贝数量。Southern blot杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法,其操作过程:利用电泳分离经酶消化后的DNA片段,然后再将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量。  


参考:

[1] Cho S W, Kim S, Kim Y, et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J]. Genome research, 2014, 24(1): 132-141.

[2] Kleinstiver B P, Prew M S, Tsai S Q, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities[J]. Nature, 2015, 523(7561): 481.

[3] Terao M, Tamano M, Hara S, et al. Utilization of the CRISPR/Cas9 system for the efficient production of mutant mice using crRNA/tracrRNA with Cas9 nickase and FokI-dCas9[J]. Experimental animals, 2016, 65(3): 275-283.

[4] Müller M, Lee C M, Gasiunas G, et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3):636–644.

[5] Qi L, Larson M, Gilbert L, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression[J]. Cell, 2013, 152(5):1173.

[6] Luke A. Gilbert, Matthew H. Larson, Morsut L, et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes[J]. Cell, 2013, 154(2):442.

[7] Hsu P D, Scott D A, Weinstein J A, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(9):827-32.

[8] Fu Y, Sander J D, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature Biotechnology, 2014, 32(3):279.

[9] Kleinstiver B P, Vikram P, Prew M S, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 variants with undetectable genome-wide off-targets:[J]. Nature, 2016, 529(7587):490-495.

[10] Slaymaker I M, Gao L, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J]. Science, 2016, 351(6268):84.

[11] Chiang T W W, Sage C L, Larrieu D, et al. CRISPR-Cas9 D10A nickase-based genotypic and phenotypic 

screening to enhance genome editing[J]. Scientific Reports, 2016, 6:24356.

[12] Pan Y, Shen N, Jungklawitter S, et al. CRISPR RNA-guided FokI nucleases repair a PAH variant in a phenylketonuria model[J]. Scientific Reports, 2016, 6:35794.

制作:

MIT麦戈文脑科学研究所

张锋

Sputnik动画


百奥赛图,基因编辑持续为您服务!

北京百奥赛图基因生物技术有限公司

百奥赛图江苏基因生物技术有限公司

BIOCYTOGEN    USA

百奥赛图基因生物技术有限公司驻上海办事处

联系电话:010-56315318

邮      箱:info@bbctg.com.cn        

网      址:www.bbctg.com.cn


(来源: 北京百奥赛图基因生物技术有限公司


全年征稿 / 资讯合作

联系邮箱:kefu@labbase.net

版权与免责声明

  • 凡本网注明“来源:来宝网”的所有作品,版权均属于来宝网,转载请必须注明来宝网, http://www.labbase.net,违反者本网将追究相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。