B细胞蛋白质抗原表位的研究方法进展

B细胞蛋白质抗原表位的研究方法进展

吴敬　吴梧桐

　　摘　要　B细胞抗原表位的研究对于免疫识别基础理论和实际应用有积极意义。文章归纳总结了近年来用于B细胞抗原表位分析的几种常用方法。
　　关键词　B细胞；抗原表位
　　中国分类号：Q26　　文献标识码：A
文章编号：1005-8915(2000)04-0239-04

Progress in the Studies of Protein B-Cell Epitope

Wu Jing，Wu Wutong
(Department of Biochemistry，China Pharmacutical University，Nanjing 210009)

Abstract　The studies of protein B-cell epitopes play a significant role in the theory of immune recognition and the practical application. In the paper，the several efficient methods in research of B-cell epitope were summarized and discussed.
Key Words　B-cell, Epitope

　　在抗原抗体的结合反应中，抗体参与结合的部位称抗体的对位(paratope)，抗原参与结合的部位以前多称为抗原决定簇，现在称为抗原的表位(epitope)［1］。抗原表位有两种分类方法［2］：一是按与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。另一是按表位结构不同分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。前者又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成；后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成。
　　表位是蛋白质抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、定点改造蛋白质分子以降低蛋白质药物的免疫原性，设计无毒副作用的人工疫苗以及免疫干预治疗等有积极的意义。
　　80年代以来，由于免疫学理论、基因工程、蛋白质工程的发展和固相多肽合成技术、生物物理技术、免疫检测技术以及计算机技术的广泛应用，使蛋白质抗原表位的研究方法和思维方法有了新的进展，发现了一些适应于蛋白质抗原表位研究的实验检测和理论预测方法。

1　抗原表位的预测法

　　该法适用于已知一级结构的蛋白质或多肽抗原的线性表位的预测。人们通过观察抗原表位与已知氨基酸序列的蛋白质某些结构特征关系，发现一些蛋白质的序列或结构特征与抗原表位有关。从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来［3］，已有许多参数、算法发表，对B细胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预测效果的方法，主要有以下6种：
　　(1)亲水性方案(Hydrophilicity)常用的有五种方法［4］：Nozaki-Tanford scale，Hopp-Woods scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale。其中尤以Hopp-Woods方案最为有名。认为蛋白质抗原各氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有密切的联系。Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确，亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性，即高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性部位。
　　(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性参数，指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性［5］。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况。
　　(3)抗原性方案(Antigenicity)对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析，Welling建立了抗原性刻度［6］。每个氨基酸用出现在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值。该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低相关性。
　　(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点，易形成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白质的Cx的温度β因子，发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法［7］。
　　(5)电荷分布方案(Charge distribution)认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的抗体多趋于碱性［8］。
　　(6)二级结构预测方案(Secondary structure)认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构规则不易形变，较难嵌和抗体，一般不作为抗原表位［9］。可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的蛋白质(αα类，ββ类，α/β类)正确率高达95%，对于未知结构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转角对预测表位有帮助。
　　对上述各种参数的预测比较表明，各种方案预测的正确率均不高。一般将上述多种方案综合考虑，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二级结构预测为重要。概括而言，作为B细胞蛋白抗原的表位首先应易于位于或移动于蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合。另外，具有一定柔韧性，因为抗原与抗体结合时蛋白构象有一定的变化。已经有一些文献提出了各自不同的综合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一种综合预测方案。权重选择为：40%来自二级结构成分，可及性、柔韧性各15%，30%来自亲水性。在吴加金等编的Goldkey软件中，以六种参数Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，Flexibility，Charge，Antigenivity综合考虑，得出综合判断图，阈值以上的峰即认为是预测的抗原表位［10］。
　　从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。

2　化学“切割”法或酶法

　　有两种方法：（1）用化学法或酶“切割”抗原，分离这些抗原肽段，然后研究它们与不同的McAb的相互作用，从而确定蛋白质的抗原表位［11，12］。该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的线性表位。在化学切割法中常用的试剂有：CNBr作用于MetDX，NTCB作用于LysDX，IBA作用于TrpDX，甲醇作用于Asp-Pro。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片段分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、玻璃体结合蛋白、髓磷脂基质蛋白等。（2）水解抗原-抗体复合物［13，14］ 这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原-抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解。根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。①对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。②对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原-抗体复合物的酶解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。③对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段以确定结果。近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。
　　综上所述，采用化学“切割”法或酶法研究抗原表位过程比较复杂，抗原-抗体结合的条件，酶解的条件，解离后的片段是否能有效分离，解离的完全程度，酶解片段的大小等对结果都会有影响。

3　肽探针扫描技术(交叠合成多肽的方法)

　　采用合成肽来检测蛋白质的抗原性始于1968年，但由于这一技术的繁琐，一直未能在蛋白质抗原表位的研究中得以发展。80年代，由于多肽固相同步合成技术的突破，使得蛋白质抗原表位研究有了突飞猛进的发展。
　　在肽同步合成技术中两个重要的技术为：
　　(1) 1984年，Houghten发明的茶袋(tea-bag)技术，成为第一代多肽同步合成技术［15］。该法在一个约3cm×4cm的bag中合成一条肽链。在合成过程中，只有当特定的氨基酸与肽链缩合时，各个bag分开单独操作，而脱保护和洗涤时均是将所有的bag放于一个聚乙烯瓶中同步操作完成，大大简化了合成过程。随着该技术的应用，人们进一步改进这一过程使其自动化，成为第二代商业化的多肽同步合成技术仪。这种仪器主要有可在X，Y，Z轴方向上自由滑动的两根针组成。一根针负责吸入试剂和保护的氨基酸，另一根负责吸出试剂。
　　(2) 1985年，Geysen发明了聚苯乙烯棒(pin)技术［16］。多肽合成过程与茶袋技术类似，只是该过程在一个聚苯乙烯棒上进行(4mm的直径，40mm长)。该棒洗涤完全并可重复使用。它最大的特点是棒上的肽可直接转入酶标板中，进行ELISA检测。
　　所谓肽扫描技术是应用上述肽合成技术合成连续的重叠的5～7肽。将这些合成的肽与相应的抗体反应，分析检测结果，以确定阳性反应片段。这一技术要求有明确的抗原的一级结构，并且检测结果为抗原线性表位。该法应用广泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生虫蛋白、烟草花叶病毒(TMV)、Fy6蛋白、鸭肝炎B病毒(DHBV)等。

4　肽库(peptide library)

　　肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合，它包括了该长度的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分，是近几年发展起来的一种技术［17］。肽库的构建有两种途径：一种是有机合成法，一种是基因工程法。
　　(1) 有机合成法就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽［18］。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现。每个载体上只含有一种序列的短肽，其优点是构建方法简单，迅速。缺点是不能扩增，筛选比较麻烦，需进行荧光标记或ELISA，在显微镜下操作工作量比较大。在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法［19］。通常从二肽开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最大结合为止。
　　(2) 基因工程法［20］ 该法先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至线性噬菌体基因组中，使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达。再利用生物素或酶标记的抗体筛出特异的噬菌体，并进行扩增，再筛选，从结合特异抗体的噬菌体DNA序列推断出氨基酸序列，并合成相应的短肽，验证筛选结果。在构建的过程中用到的载体系统来源于丝状噬菌体的两个外壳蛋白基因PⅢ和PⅤ。图1为PIII载体构建示意图。在每个融合蛋白中各有一个氨基酸序列的可变区。这一区域的氨基酸组成决定于随机合成的简并密码子NNK或NNM(N代表A，T，G，C;K代表G，T;M代表A，C)。由NNK或NNM代表的32种密码子可指导合成全部20种氨基酸，且包含一个终止密码子UAG。

Fig 1　Construction of the epitope library

　　这种由基因工程方法构建的噬菌体库又称为表位文库。表位文库构建的成功与否，噬菌体克隆的数目是一个决定因素。以随机六聚体氨基酸为例，10亿种左右(326)的DNA序列编码大约6400万种(206)的氨基酸序列。因此要使所有可能的氨基酸序列都包含在文库中，至少需要10亿个独立的克隆才行。考虑到密码子的简并性，一般2亿～3亿个独立克隆的表位文库就能顺利地进行下一步的筛选。用此法检测的抗原表位有人H铁蛋白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等。
　　肽库技术还存在一些需要改善的地方。首先，目前所建的肽库只能达到109，构建大片段的肽库很困难。其次，肽的多样性问题。第三，少数肽或者由于过于疏水，或者由于影响外膜蛋白的折叠而不能在噬菌体外正确表达。作为一种新技术，类似的具体问题还很多。但这些暂时的缺点并不能掩盖它的巨大应用潜力。

5　Ag-Fab复合物的X射线衍射和核磁共振(NMR)分析

　　X射线衍射被认为是唯一真正能反映抗原、抗体相互识别的一种技术［21］。该技术为最初研究抗原抗体相互作用时抗原中氨基酸的参与识别情况以及表位类型(线性或构象型)这类理论问题提供了实验依据。但该技术受获得抗原-抗体复合物的晶体的限制。NMR方法可避免结晶［22］，但其只能研究小分子的多肽抗原。由于对仪器设备的特殊要求，该技术在一般实验室的应用受到限制。

6　对于基因工程技术所得的蛋白质的抗原表位研究，可采用一些特殊的技术［23］

　　如用限制性酶消化相关核苷酸片段或插入特定核苷酸，将这些基因产物在合适的载体系统如酵母、大肠杆菌或噬菌体中表达。将免疫检测为阴性的个体再测序分析。此外，对于已获得抗原表位片段的这类蛋白，可用抗原表位中的个别氨基酸的定点突变技术来研究其中每个氨基酸对表位的贡献。
　　蛋白质B细胞抗原表位研究的一些常用方法，在实际应用时，常根据具体情况选择应用。

吴敬(中国药科大学生化教研室，南京210009)
吴梧桐(中国药科大学生化教研室，南京210009)

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收稿日期　1999-07-08