牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

中国病毒学 2000年第1期第15卷 简 报

作者：王世珍 张莉 刘佳建 刘淑红 陈启民 耿运琪

单位：南开大学生命科学院，天津 300071

关键词：牛泡沫病毒；长末端重复序列；内部启动子

分类号： Q75 文献识别码： A 文章编号： 1003-5125(2000)01-0093-04 Activity Comparison and Mechanism of Two Promoters of Bovine Foamy Virus

WANG Shi-zhen, ZHANG Li, LIU Jia-jian, LIU Shu-hong, CHEN Qi-min, GENG Yun-qi

(College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China)

Abstract： Two promoters, LTR (long terminal repeat) and IP (internal promoter), exist in genomes of foamy viruses. Cell transfection and transient ex pression assay demonstrated that: the basal activity of BFV (bovine foamy virus ) IP is much higher than that of BFV LTR; transactivator of BFV—Borf-1, which activates gene expression directed by BFV LTR, also functions on BFV IP with an activation fold higher than that on LTR. The results suggest that BFV IP and LTR may regulate viral gene expression by different mechanisms, and that Borf-1 ma y stimulate BFV IP and LTR in different ways. In addition, an in vivo DNA competition assay demonstrated that a common transcription factor may be involved in both mechanisms of the two promoters. Key words ： Bovine foamy virus; Long terminal repeat; Internal promoter▲ 牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)属反转录病毒科泡沫病毒属。其基因组两端为长末 端重复序列(Long terminal repeat, LTR)，中间部分除gag\,pol\,env三个结构基因外，还 有两个重叠的读码框ORF-1、2，起始于env基因3′端，终止于3′LTR，编码Borf-1、Borf - 2等多种调节蛋白^［1～3］。其中Borf-1为BFV的反式激活因子，可显著激活BFV L TR启动子起始的基因表达。近年来，在泡沫病毒家族成员人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV)和猴泡沫病毒(Simian foamy virus, SFV)1型、3型中，陆续发现了除5′LTR启动子 之外的第二类启动子^［4～6］。该启动子位于env基因内部、调节蛋白编码区上游 ，称为内部启动子(Internal promoter, IP)。本实验室也已从BFV基因组的相应位置克隆到 了有活性的IP片段。本文通过瞬时表达，分析比较了BFV LTR和IP两类启动子的基础活性和 在B orf-1作用下的激活活性，并运用体内DNA竞争分析初步探讨了BFV两类启动子作用机制的异同。 1 材料与方法

1.1 质粒构建 以本实验室分离鉴定的BFV3026中国毒株为材 料^［7］，克隆到了含全长LTR的-55/1257片段、含全长IP的8564/9509片段 ，以及9538/10365 ORF-1片段(核苷酸按基因组全序列中编号，完整的原病毒cDNA中相 当于毒粒基因 组RNA5′端不完整LTR上游的核苷酸编号为负值)。将前两个片段连至pGEM-T载体(购自Prom ega公司)，得到pT-BFVLTR和pT-BFVIP，再将T载体上的LTR片段和IP片段取代本室保藏的 质粒pBIVLTR-luc^［8］ (BIVLTR下游连有荧光素酶报告基因luc)中的BIVLTR，得到 报告质粒pBFVLTR-luc和pBFVIP-luc。将ORF-1片段取代质粒pRSV-cat(RSV启动子下游连 有报告基因cat)中的cat基因，得到Borf-1表达质粒pBFVORF-1。

1.2 细胞培养和转染 牛肺细胞系BL-12用补加10%胎 牛血清的DMEM培养基(购自GIBCO/BRL)，于37℃，5%CO₂条件下培养。采用Lipofect AMI NE^TM试剂(购自GIBCO/BRL)，参用该试剂产品说明书上粘着细胞转染法转染细胞。六 孔板中每孔铺2×10⁵个细胞，转染时每孔Lipofect (2mg/mL)用量3μL，不同DNA的用 量见结果与讨论部分。

1.3 荧光素酶活性测定 转染48h后裂解细胞， 使用 荧光素酶检测试剂盒(购自Promega公司)，在生物化学发光测量仪(购自上海检测技术所)上 测定荧光素酶活性(方法参见该试剂盒操作说明)。

2 结果与讨论 2.1 基础活性比较 分别以不同用量的pBFVLTR-luc和pBFVIP-lu c转染BL-12细胞系，通过检测被相同用量的pBFVLTR-luc和pBFVIP-luc转染后细胞所表达 的荧光素酶活性，比较BFV LTR和IP的基础活性。结果如表1所示。在相同用量下pBFVIP- lu c比pBFVLTR-luc转染细胞所得的luc活性高得多，说明BFV IP的基础活性远远高于BFV LTR 。BFV LTR的基础活性很低，说明在无反式激活因子存在的情况下，它几乎不表现启动子活 性。这一点与HFV、SFVs LTR研究结果是一致的。 表1 BFV LTR和IP的基础活性^a Table 1 Basal activity of BFV LTR and IP^a

报告质粒 Reporter plasmids	不同报告质粒用量下的荧光 素酶活性 Luc activities when transfected with various doses of reporter
0μg	0.1μg	0.2μg	0.5μg	1μg
pBFVLTR-luc	10	11	12	18	27
pBFVIP-luc	10	163	470	781	1956

^a所有转染均设β-gal内对照校正系统。为了方便起见，用μg数表示质粒用量，因p BFVLTR-luc和pBFVIP-luc的大小相近，均在6.8～7.1kb之间，μg数相同可近似认为分 子数相同。 ^aβ-gal normalizing system is introduced into each transfection. Doses of plasmids are showed in μg for convenience. Since sizes of pBFVLTR-luc and pBF vIP-luc are similar and both limited to 6.8～7.1kb, similar doses in μg can be approximately regarded as similar moles.2.2 激活活性比较 为了检测BFV LTR和IP对反式激活因子 Borf-1的应答情况，分别将pBFVLTR-luc或pBFVIP-luc与pBFVORF-1共转染细胞，结果如 表2所示。Borf-1对-55/1257全长LTR片段的最高激活倍数为20.1倍，出现在Borf-1表 达质 粒与报告质粒的用量比为1∶1的情况下，这时被激活的BFV LTR已明显表现出启动子活性； 而Borf-1对8564/9509全长IP片段的最高激活倍数达152.2倍，出现在两质粒用量比为2 .5∶ 1的情况下。这说明BFV IP不但也可被BFV反式激活因子Borf-1显著激活，而且激活倍数远 远高于Borf-1对BFV LTR的激活。此外，IP与LTR达到最大激活倍数所需Borf-1用量的差异 ，也暗示了Borf-1通过不同的机制激活IP与LTR。 表2 BFV LTR和IP的激活活性^a Table 2 Increased activity of BFV LTR and IP^a

报告质粒b Reporter plasmidsb	与不同用量pBFVORF- 1共转染的荧光素酶活性 Luc activities when cotransfected with various doses of pBFVORF-1	最高激活倍数 Highest increasing fold
0∶1c	1∶2	1∶1	2.5∶1	5∶1
pBFVLTR-luc	27	217	542	393	-	20 .1
pBFVIP-luc	470	8177	9720	71536	21789	152.2

^a同表1。^bpBFVLTR-luc转染用量1μg，pBFVIP-luc转染用量0.2μg。 ^cpBFVORF-1与报告质粒用量比为0∶1。 ^aAs in table 1. ^b1μg pBFVLTR-luc or 0.2μg pBFVIP-luc is used in transfection.^cRatio between doses of pBFVORF-1 and reporter plasmid i s 0∶1. 2.3 机制探讨 为了初步探讨BFV两类启动子的作用机制， 我们进行了体内DNA竞争分析(in vivo DNA competition assay)。如果Borf-1的反式 激活作用需要某种细胞因子，而这种细胞因子的量又是有限的，那么当细胞同时被报告质粒 和多拷贝的该因子靶位点共转染时，这种细胞因子将被耗尽，对细胞因子的竞争将导致报告 基因的表达下降。分别以pT-BFVIP或pT-BFVLTR为竞争质粒，在pBFVORF-1存在的情况下，与报告质粒pBFV LTR-luc或pBFVIP-luc共转染细胞，结果如表3所示。IP的存在导致LTR起 始的luc表达下降，而LTR的存在也导致IP起始基因表达的下降。BFV LTR与IP之间存在随剂 量增加而增强的竞争关系，说明有某种细胞因子同时参与了Borf-1激活这两类启动子的过程。 表3 BFV LTR和IP的DNA竞争分析^a Table 3 DNA competition assay between BFV LTR and IP^a

竞争质粒 Competitor plasmids	报告质粒b Reporter plasmidsb	不同竞争质粒用量下的荧光素酶活性 Luc activities when cotransfect ed with various doses of competitor
无竞争质粒 No competitor plasmids	10倍c 10-foldc	20倍 20-fold
pT-BFVLTR	pBFVLTR-luc	262	14	12
pT-BFVIP	pBFVLTR-luc	262	12	11
pT-BFVIP	pBFVIP-luc	21789	11271	8228
pT-BFVLTR	pBFVIP-luc	21789	7122	5657

^a转染中均使用过量的pBFVORF-1以保证Borf-1过量。为消除转染效率不同造成的系 统误差，用无关质粒pGEM-T将所有转染的DNA总量补至14μg。^b同表2。^c竞 争质粒分子数是报告质粒的10倍。 ^aExcess pBFVORF-1 was used in transfection to make sure that Borf-1 is s ufficient. All transfections are carried out in a total of 14 μg DNA supplemen ting with control plasmid pGEM-T, to avoid system errors of transfection effici ency difference.^bAs in table 2.^cCompetitor plasmids are 10-fold mol ar excess over reporter plasmids. 关于LTR和IP两类启动子同时存在在泡沫病毒基因表达调控中的意义，1994年Mergia在对SFV -1的研究中提出了“时序模式(Temporal pattern)”^［5］。该模式认为，和许多D NA病毒一样，泡沫病毒在复制周期的不同时期，由不同的阶段特异性启动子(Stage-specif ic promoter)控制不同的基因表达。在病毒感染的早期，LTR几乎不表现启动子活性，由IP 起始转录，表达出病毒的调节蛋白；随后，泡沫病毒反式激活因子(Transactivator of foa my virus, Taf)一方面作用于LTR，激活LTR的启动子活性，表达出病毒结构蛋白；另一方面 反馈激活IP，合成更多的调节蛋白。本研究通过瞬时表达分析证明，无Borf-1存在时，即 相当于病毒感染的早期，BFV IP的活性远远高于LTR，有一定量的基础表达；而有Borf-1存 在时，即相当于病毒凭借IP的基础活性表达出部分调节蛋白后，Borf-1不但可以激活LTR起 始的基因表达，同时也可以显著激活IP的表达。这一结果支持了“时序模式”，揭示了BFV 与HFV、SFV-1、3有着相似的基因表达调控机制。 本室通过缺失分析和杂合启动子构建已初步确定了BFV LTR上的Tas应答元件(Tas-responsi ve element, TRE)，并发现RU5区具有负调控作用(另文发表)。由于本研究所用的-55/125 7全长LTR片段含有完整的RU5区，可能是造成LTR的激活活性低于IP的原因之一。总之，BFVIP的基础活性远远高于LTR，在Borf-1作用下的激活倍数也显著高于LTR，而且达到最高激 活倍数所需的Borf-1用量也不同于LTR，暗示BFV IP与LTR起始基因表达以及被Borf-1激活 是通过不同的机制，但是可能同时需要某种转录因子。进一步的研究将确定IP上TRE的位置 ，以及IP和LTR起始基因转录所需要的细胞因子，以揭示泡沫病毒复杂的基因表达调控机制。■ 基金项目：国家自然科学基金(39770032)和教育部博士点基金资助项目(98005516) 作者简介：王世珍(1978-)，女，籍贯天津市。南开大学生物化学与分子生物学系在读分子遗传学博士。 耿运琪(1947-)，男，籍贯河北省。南开大学生命科学学院分子病毒学教授。 参考文献：

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［6］Renne R, Fleps U, Luciw P A et al. Transactivation of the two promoters of SFV-3 by different mechanisms ［J］. Virology, 1996,221:362～367

［7］刘淑红，陈荷新，陈家童等.牛泡沫病毒3026毒株的分离及分子生物学鉴定［J］.病毒学报，1997，13：140～145

［8］刘国文，纪永刚，梁臣等.萤火虫荧光素酶基因构建BIV-LTR启动子表达体系［J］.病毒学报，1994，10：377～380

收稿日期：1998-11-30

修稿日期：1999-03-18