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高分辨率熔解曲线(HRM)分析预混Mix(PCR),精准基因筛查!

武汉艾美捷科技有限公司2019年3月6日 9:00 点击:1853


高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis,HRM)是国际上发展的一种新型的检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及扫描突变的新技术。HRM 无需使用序列特异性探针,而是利用一种饱和染料对 PCR 反应产物进行分析。

HRM技术因操作简便快捷、成本低廉、结果准确,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍关注。

 

HRM原理: 

PCR反应前将新型DNA饱和荧光染料加入反应体系,然后将PCR产物直接导入高分辨熔解分析仪中,在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行加热变性,仪器的光学检测系统采集、分析荧光信号并绘制温度熔解曲线,根据不同熔解曲线形状来区分(单个)碱基差异。 

最广泛的 HRM 分析应用领域是基因筛查。基因筛查是搜索 PCR 扩增片段中是否存在未知变异,它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。由于 PCR 产物突变可导致 DNA 熔解曲线的形状改变,因此它可以利用 HRM分析检测。杂交双链 DNA 样本扩增并熔解时,其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。如果操作得当,可以减少至少95%的测序工作量。随着DNA染料和分析仪器的发展,HRM技术还将继续完善和改进,在遗传病分子诊断领域发挥更多的作用。 

 

HRM应用: 

• 基因筛查 (突变研究)

• 杂合性研究

• 突变分析

• 物种鉴定

• 单核苷酸多态性 (SNP) 检测

• 甲基化分析

 

作为专注于PCR领域超过24年的高品质试剂供应商,Solis BioDyne为您推荐,5X热启动EvaGreen高分辨率熔解曲线分析-预混Mix(PCR): 

名称

货号

兼容的PCR仪器

5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (NO ROX)

08-31-00001

Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™
Qiagen: Rotor-Gene® 6000
Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4
Illumina: The Eco™
Roche: LightCycler® 480

* 不含参比染料ROX,如需要含ROX,请选择:08-33-00001

5X热启动EvaGreen高分辨率熔解曲线分析-预混Mix(PCR)提供如下组分:

1

极高的性价比(进口品质,国产价格): 

品牌

货号

规格

目录价(元)

单次反应价格(元)

Solis BioDyne

08-31-00001

1ml(250次)

386

1.54

Thermo

4415452

5*5ml(2500次)

18856

7.54

Qiagen

206546

25ml(2000次)

21810

10.9

DBI

DBI-2232

1000次

11000

11

天根(Tiangen)

FP210-02

500次

2480

4.96

宇恒生物(UE)

S2013

500次

2300

4.6

推荐的qPCR反应体系配置: 

组分

体积

终浓度

5x HOT FIREPol® EvaGreen® HRM Mix

4 µl

1x

正向引物 (10 pmol/µl)

0.16-0.5 µl

80-250 nM

反向引物 (10 pmol/µl)

0.16-0.5 µl

80-250 nM

DNA模板

可变

可变

H2O(PCR级)

up to 20 µl

 

Total

20 µl

 

* DNA模板浓度:cDNA 0.1 pg/μl -10 ng/μl ; gDNA 10 pg/μl – 4 ng/μl

推荐的qPCR反应程序: 

循环步骤

温度

时间

循环数

起始激活(热启动)

95ºC

12 min

1

变性

 95ºC

15 s

40

退火

60º-65ºC

20 s

延伸

72ºC

20 s

 

发表文章实验结果展示:

1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?” European Journal of Human Genetics 26 (2018): 1708-1712.

使用Solis试剂盒,分析PAX2基因4号外显子的错义突变

2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.” Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.

使用Solis试剂盒,分析CDKAL1基因SNP

HRM分析成功的关键: 

1.保持较短的扩增片段,实现最高的灵敏度。与较大的扩增片段相比,100 bp 左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。

2.确保 PCR 扩增片段的特异性。错配产物和引物二聚体可使数据解释复杂化。引物浓度低于 200nM,MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范围及使用热启动DNA 聚合酶将有助于获得高特异性。

3.确保反应使用足够的模板。一般而言,Ct 应低于30,以生成足够的材料,实现准确的熔解分析。 

除了上述的高效稳健的HRM分析预混Mix产品,Solis BioDyne为客户提供终点PCR(end-point PCR),qPCR(real-time PCR),反转录PCR(Reverse transcription),以及其它PCR所需的配套试剂。产品线纵览图如下:

 

Solis BioDyne来源于欧盟-爱沙尼亚共和国,专注PCR领域超过24年,Solis BioDyne一直致力于开发和生产高品质的生命科学试剂,现已成为当今欧洲领先的试剂供应商之一。高标准的生产标准和服务使Solis BioDyne成为全球值得信赖的首选PCR供应商。我们的DNA聚合酶,PCR Master Mixes,qPCR Mixes和其它试剂被全球110多个国家的研究者所使用,包括顶级研究机构和生物技术公司。 

Solis BioDyne拥有独家的蛋白质稳定技术专利,确保其PCR酶与PCR Mixes产品具有极高的稳定性,研究者可以常温运输以及常温下配置PCR反应体系(无需冰盒)。即使是室温放置30天,其酶活性也没有损耗。 

作为Solis BioDyne在中国的区域总代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供最全面的Solis BioDyne产品以及订制服务。

 


(来源: 武汉艾美捷科技有限公司


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