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PNAS | 小鼠PARL缺乏导致线粒体内膜复合物III缺陷、辅酶Q耗竭和Leigh样综合征

北京华威中仪科技有限公司2022年11月18日 5:17 点击:495

PARL蛋白酶是菱形家族中wei一已知的线粒体蛋白酶成员。菱形蛋白酶是一种线粒体膜内切割蛋白酶和假蛋白酶,涉及多种功能。菱形蛋白酶常与人类流行疾病(包括癌症和神经退行性疾病)具有一定的病理相关性,菱形蛋白酶在维持线粒体结构和功能方面具有重要的生理作用。当 PARL 蛋白酶被消融时线粒体会严重受损,可导致神经Leigh 样变性,类似于人类线粒体疾病Leigh综合征。这种显著的神经变性与细胞凋亡的改变无关,而是与大量坏死有关,这引发了潜在机制性的问题。

鲁汶大学VIB(脑与疾病)研究所与伦敦大学IKU研究所对PARL缺陷型小鼠的脑部线粒体进行呼吸代谢与线粒体膜电位、ROS、钙离子等方面进行检测,该文章“PARL deficiency in mouse causes Complex III defects,coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome”于2019年发表 《PNAS》 杂志上,文章中假设Parl-/- Leigh氏综合征是由线粒体内膜 CIII 和 CoQ 缺陷的组合决定呼吸链功能障碍从而导致的。然而,也不能排除由 PARL 缺乏引起的其他线粒体功能和结构缺陷,也可能引发神经变性的发病机制。

该文中使用O2k对模型鼠脑部线粒体、神经突触细胞进行了耗氧率、线粒体膜电位、ROS和钙离子浓度进行了分析,分析结果如下:

一、Parl - / -脑线粒体中的 CIII 和 CoQ 缺陷。使用O2k高分辨率呼吸代谢检测系统对脑神经元线粒体进行检测。蓝色曲线表示氧气浓度,红色曲线表示其耗氧率。纯化的突触体(50 µg) 装入 Mir06 缓冲液中。滴定洋地黄皂苷 (Digi) 以实现z佳突触体通透化。底物如下:CI(PMG,丙酮酸+苹果酸+谷氨酸),CII(Succ,琥珀酸)和CIV(ASC/TMPD,抗坏血酸+TMPD)。解耦联剂是 CCCP。抑制剂如下:CI(ROT,鱼藤酮)、CIII(Aa,Antimycin a)和 CIV(KCN,氰化钾)。呼吸状态用红色虚线表示。CI LEAK,CI 驱动的质子漏呼吸;CI OXPHOS,CI 驱动的磷酸化呼吸;CI+II OXPHOS,由 CI 和 II 的联合激活驱动的磷酸化呼吸;CI+II ET,由CI和II组合驱动的电子转移能力;CII ET,由CII驱动的ET;CIV,CIV 驱动的呼吸;Cytc,外源性细胞色素添加c以评估线粒体外膜的完整性。在过氧化氢酶存在下使用H2O2为腔室重新充氧。

二、使用O2k荧光检测模块,同时对 PARL 缺乏是否会损害脑线粒体中其他重要的线粒体功能进行评估。包括:线粒体钙保留能力、线粒体膜电位、ROS的生成能力

使用O2k荧光模块以及Calcium Green 5N试剂对纯化的脑线粒体进行钙保留能力测试,发现Parl-/-的钙保留量明显降低

使用O2k荧光模块及safranin O试剂对脑线粒体中的线粒体膜电位(即Δψ)进行检测,明显可见Parl-/-脑线粒体膜电位降低

使用O2k荧光模块及Amplex UltraRed试剂对线粒体产生的ROS进行检测,除了使用 CI 底物略有增加外,所有实验条件下的 ROS 产生都相似

结果表明:PARL缺乏是对大脑氧化应激的主要影响,但我们发现对线粒体钙代谢同样也产生了严重影响。线粒体钙是细胞死亡(包括坏死)的关键决定性因素,在许多神经退行性疾病中尤为重要,包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病以及由另一种线粒体蛋白酶AFG3L2突变引起的遗传性神经系统疾病。


参考文献:Spinazzi M, Radaelli E, Horré K, Arranz AM, Gounko NV, Agostinis P, Maia TM, Impens F, Morais VA, Lopez-Lluch G, Serneels L, Navas P, De Strooper B (2019) PARL deficiency in mouse causes Complex III defects, coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 116:277-86.


(来源: 北京华威中仪科技有限公司


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