动物细胞培养液制备

动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。细胞培养液作为细胞培养的基础物质，它的质量直接影响了实验培养结果，其基本制备方法如下：

一、器材与试剂

 RPMI-1640干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.蒸馏水、电子天平、PH计、磁力搅拌器、5.6%的NaHCO3

二、实验原理   

动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。配制这些常用液有严格的要求：

(1)使用高纯化的三蒸水。

(2)按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。(3)保证各组分完全溶解。

(4)进行pH值测试和调整。

(5)消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。

三、具体步骤  

1、酚红（0.1%）  配法：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。2、Hanks平衡盐溶液。（Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。）1.按表称取Hanks、D-Hanks试剂。

注意事项：

1.BSS的pH值应确定为7.2左右。

2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。 

3、细胞消化液：0.25％胰蛋白酶液  1.称取0.25g胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL 2.滤过除菌，调pH值7.4，-20℃冻存。

4、10000单位／ml硫酸链霉素、青霉素G钾盐的配制 硫酸链霉素 1g 青霉素G钾盐       100万单位  将上述两种药品溶于100mL生理盐水中，然后灭菌（过0.45μm的滤膜），分装于青瓶中放－20℃保存。使用时可按100单位／mL稀释。

 5、胎牛血清  市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。  1.将血清加热至56℃并保持30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 2.处理后的血清贮存于4℃。 

6、RPMI 1640培养液（基本培养基）  

① 配1升RPMI1640培养液的粉末(1袋)+2gNaHCO3。 ②溶于800mL蒸馏水中充分搅匀。 ③ 用HCl调节PH7.2-7.4。 ④ 用蒸馏水补足1L。 ⑤ 用灭过菌的滤器过滤（用φ0.45或0.20μm滤膜）。 ⑥ 用灭过菌的瓶分装（学生实验）100ml/瓶。  RPMI 1640完全培养基按如下比例配制：基本培养基占90%，小牛血清占10%1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。