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Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒

上海前尘生物科技有限公司2017年4月10日 10:29 点击:1680

Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒

—重组·高效·定向·快速

Hieff CloneTM一步法快速定向克隆技术基于DNA序列同源性进行片段重组,克服了传统克隆技术的众多缺陷,如受到酶切位点的限制,会附加多余碱基序列,操作过程十分繁琐,克隆效率低等。它可以将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff CloneTM一步法快速定向克隆技术简便、快速、高效,是DNA无缝克隆的首选。

Hieff CloneTM技术优势:

无需考虑酶切位点不受插入DNA片段限制性酶切位点的限制,适用于任何载体。

设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

快速高效:50℃,20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

无缝克隆:插入位点不会引入额外的碱基序列。

Hieff CloneTM实验流程:

Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒,实验流程见下图1

 

1Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。

①线性化载体的制备:酶切或PCR制备线性化载体。②插入片段的制备:在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右末端同源序列;PCR反应扩增目的片段。③重组反应:按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组,50℃反应20 min。④转化、涂板:将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。

产品实例:

1.单片段高效重组

2Hieff CloneTM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。A-D:重组转化平板。E:插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H:插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体:pFastBac14.7 kb,插入片段大小分别是1.2 kb3 kb5 kb,载体量:100 ng/20 μl反应体系,载体与插入片段摩尔比:1:3,反应条件:50℃20 min

2. 多片段轻松重组

3Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆A:重组转化平板。B:插入片段和载体浓度检测电泳图。CPCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体:pCAMIBA130210 kb,三个插入片段长度:1 kb1.5 kb2.5 kb,载体量:160 ng/20 μl反应体系,重组反应条件50℃20 min

3. 载体与插入片段摩尔比1:3左右最适

4Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试A-C:重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2A),1:3B)和1:4C),重组反应条件50℃20 min

4. 重组反应时间20-30 min最佳

5Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行不同重组反应时间克隆测试A-C:重组转化平板。重组反应时间分别是20 minA),25 minB)和30 minC),重组反应温度50℃

客户案例展示:

1.超高的阳性率

客户单位:中国科学院植物生理生态研究所

6:使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆,阳性率100%A:重组转化平板。B:克隆基因PCR鉴定电泳图。载体:10 kb,插入片段:300 bp,载体浓度:50 ng/μl插入片段浓度:50 ng/μl,载体与插入片段摩尔比例为1:1重组反应条件50℃20 min

2.低浓度载体重组

客户单位:西南大学

7:使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。A:重组转化平板。B:载体浓度检测电泳图。C:插入片段浓度检测电泳图。D:克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体4.7 kb,插入片段1.6 kb,载体浓度:5 ng/μl,插入片段浓度:25 ng/μl,载体与插入片段摩尔比例为1:2,重组反应条件50℃20 min

超高性价比

8Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比,显示出更高的性价比。

FAQ

Q1Hieff CloneTM克隆的原理是什么?

A1 利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q2:与传统克隆相比,Hieff CloneTM克隆有什么优势?

A21)无需考虑酶切位点:不受目的DNA片段限制性酶切位点的限制,适用于任何载体。

2)设计简单:在目的片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

3)快速高效:50℃20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

4)无缝克隆:插入位点不会引入额外的碱基序列。

Q3:同源序列长度对重组效率的影响?

A3:同源序列的长度与克隆数目有相关性,一般同源片段选择在20 bp左右,可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。

Q4:线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗?

A4:线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应,建议割胶回收纯化产物。

Q5:一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗?

A5:推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如YeasenDH5αcat NO. 11802ES),TOP10cat NO. 11801ES)等。

Q6:线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例?

A6载体使用量应大于0.01 pmol,推荐使用量0.03 pmol;克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内,最适1:2-1:3,超过范围可能会影响克隆效率。

Q7:一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些?

A7:本试剂盒适用于绝大多数基于常规酶切-连接方法的克隆实验,并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。

Q8:多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗?

A8:多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是,单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆,重组效率可能会受到影响。

Q9:一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃,是否可以在37℃进行反应?

A9:一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构,同时是Hieff CloneTM重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应,请根据实验需要进行优化。

订购信息

产品名称

产品货号

规格

促销价()

Hieff CloneTM One Step Cloning Kit

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关键词

无缝克隆;同源重组;Seamless;homologous recombination;多片段克隆。

产品发表文献

[1] Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271. (皖南医学院)

[2] Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377. (山东农业大学)

 

公司介绍

上海翊圣生物科技有限公司(Yeasen biotech Co., Ltd.)成立于2009年,总部位于上海国际医学园区。翊圣生物立足于酶制剂生产,为分子诊断公司提供国际一流品质的酶制剂及相关原辅料。翊圣以酶制剂为基础研发新产品,目前产品主要面向分子诊断、科研和高通量建库相关领域。未来的产品将涉足食品安全和宠物疾病检测等领域。

 

研发团队

上海翊圣生物科技有限公司的主要研发人员来自国内一线科研院所:如中科院、上海交大、武汉大学、华东师范大学、厦门大学、上海师范大学和南京农业大学等。翊圣聘请组建了顶级的技术顾问团队,成员来自国内外一流大学,如耶鲁大学,加州伯克利、中科院大学等等,拥有丰富的科研经验以及外企工作的经历。优秀的人才是翊圣产品的品质保证,优秀的人才是翊圣的未来。

 

研发平台

翊圣生物不断开拓创新,通过蛋白分子结构的定向设计与大规模酶蛋白的突变筛选,为客户提供性能卓越的酶制剂产品。

翊圣建有四大蛋白重组表达体系,原核大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。公司有大规模的发酵系统和高通量的酶纯化系统,保证为客户提供大规模、高纯度和批次稳定的高品质原料。

翊圣产品是您分子诊断的品质保障。

 

 


(来源: 上海前尘生物科技有限公司


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