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小鼠白介素6(IL-6)ELISA Kit灵敏度: 0.39 pg/ml发表近20篇文献

厦门慧嘉生物科技有限公司2017年1月11日 16:03 点击:160

小鼠白介素6(IL-6)ELISA Kit灵敏度: 0.39 pg/ml发表近20篇文献

特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的,且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期:6个月

预期应用:ELISA法定量测定血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的含量。

说明

1.试剂盒保存:-20(较长时间不用时);2-8(频繁使用时)。

2.浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

3.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.         酶联板(Assay plate ):一块(96孔)。

2.         标准品(Standard):2瓶(冻干品)。

3.         样品稀释液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。

4.         生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。

5.         辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。

6.         生物素标记抗体(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1100

7.         辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1100

8.         底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。

9.         浓洗涤液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

 

需要而未提供的试剂和器材

1.         标准规格酶标仪

2.         高速离心机

3.         电热恒温培养箱

4.         干净的试管和Eppendof

5.         系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器

6.    蒸馏水,容量瓶等

标本的采集及保存

1.         血清:全血标本请于室温放置2小时或4过一晚后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

2.         血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

3.         细胞培养物上清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则:

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。最后计算浓度时,稀释了“N倍,标本的浓度应再乘以“N

标准品的稀释原则:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为300 pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释300 pg/ml150 pg/ml75 pg/ml37.5 pg/ml18.5 pg/ml9 pg/ml4.5 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。

如配制150 pg/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

生物素标记抗体的稀释原则:

临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:

临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37反应120分钟。

为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37,60分钟。

3.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。

4.         每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl3760分钟。

5.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90μl37避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。

7.         依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

注:

1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。

4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。

2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

3. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

5. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

6. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

7. 底物请避光保存。

8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。



(来源: 厦门慧嘉生物科技有限公司


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