光学显微镜原理分析续

（五）目镜

目镜的作用是把物镜放大的实象（中间象）再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。已知显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。因此，对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。

（六）聚光镜

聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。

聚光镜的的结构有多种，同时根据物镜数值孔径的大小，相应地对聚光镜的要求也不同。

1．阿贝聚光镜（Abbecondenser）

这是由德国光学大学大师恩斯特.阿贝(ErnstAbbe)设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好的聚光能力，但是在物镜数值孔径高于0.60时，则色差，球差就显示出来。因此，多用于普通显微镜上。

2．消色差聚光镜(Achromaticaplanaticcondenser)

这种聚光镜又名"消球差聚光镜"和"齐明聚光镜"，它由一系列透镜组成，它对色差球差的校正程度很高，能得到理想的图象，是明场镜检中质量最高的一种聚光镜，其NA值达1.4。因此，在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于4X以下的低倍物镜，否则照明光源不能充满整个视场。

3．摇出式聚光镜（Swingoutcondenser）

在使用低倍物镜时（如4X），由于视场大，光源所形成的光锥不能充满真整个视场，造成视场边缘部分黑暗，只中央部分被照亮。要使视场充满照明，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。

4．其它聚光镜

聚光镜除上述明场使用的类型外，还有作特殊用图的聚光镜。如暗视场聚光镜，相衬聚光镜，偏光聚光镜，微分干涉聚光镜等，以上聚光镜分别适用于相应的观察方式。

（七）照明方法

显微镜的照明方法按其照明光束的形成，可分为"透射式照明"，和"落射式照明"两大类。前者适用于透明或半透明的被检物体，绝大数生物显微镜属于此类照明法；后者则适用于非透明的被检物体，光源来自上方，又称""反射式照明"。主要应用与金相显微镜或荧光镜检法。

1．透射式照明

生物显微镜多用来观察透明标本，需要以透射光来照明。有两种照明方式

（1）临界照明（Criticalillumination）光源经过聚光镜后，成像于物平面上，如图5所示。若忽略光能的损失，则光源像的亮度与光源本身相同，因此，这种方法相当于在物平面上放置光源。显然，在临界照明中，如果光源表面亮度不均匀，或明显地表现出细小的结构，如灯丝等，那么就要严重影响显微镜观察效果，这是临界照明的缺点。其补救的方法是在光源的前方放置乳白和吸热滤色片，使照明变得较为均匀和避免光源的长时间的照射而损伤被检物体。用透射光照明时，物镜成像光束的孔径角，被聚光镜像方光束的孔径角所决定，为使物镜的数值孔径得到充分利用，聚光镜应有与物镜相同或稍大的数值孔径。
（2）柯拉照明临界照明中物面光照度不均匀的缺点，在柯拉照明中可以消除。在光源1与聚光镜5之间加一辅助聚光镜2，如图6所示。可见，由于不是直接把光源，而是把被光源均匀照明了的辅助聚光镜2（也称为柯拉镜）成像在标本6上，所以物镜的视场（标本）得到均匀的照明。

2．落射式照明

在观察不透明物体时，例如通过金相显微镜观察金属磨片，往往是采用从侧面或者从上面加以照明的方式。此时，被观察物体的表面上没有盖玻璃片，标本像的产生是靠进入物镜的反射或散射光线。如图7所示。

3．用暗视场来观察微粒的照明方法

用暗视场方法可以观察超显微质点。所谓超显微质点，是指那些小于显微镜分辨极限的微小质点。暗视场照明的原理是：不使主要的照明光线进入物镜，能够进入物镜成像的只是由微粒所散射的光线。因此，在暗的背景上给出了亮的微粒的像，视场背景虽暗，但衬度（对比）很好，可以使分辨率提高。

暗视场照明又有单向和双向之分

（1）单向暗视场照明图8是单向暗视场照明示意图。由图可见，由照明器2发出的光线，经不透明的标本片1反射后，主要的光线都没有进入物镜3，进入物镜的光线主要是由微粒或凸凹不平的细部所散射的光线。显然，这种单向的暗视场照明，对观察微粒的存在和运动是有效的，但对物体细节的再现不是有效的，即存在"失真"的现象。

（2）双向暗视场照明双向暗视场照明，可以消除单向所产生的失真缺点。在普通的三透镜聚光镜前面，安置一个环形光阑，如图9即可实现双向暗视场照明。在聚光镜的最后一片与载物玻璃片之间浸以液体，而盖玻璃片与物镜之间是干的。于是，经过聚光镜的环形光束，在盖玻璃片内全反射而不能进入物镜，形成如图中的回路。进入物镜的只是由标本上的微粒所散射的光线，形成了双向暗视场照明。



四、光学显微镜的组成结构

光学显微镜包括光学系统和机械装置两大部分，而数码显微镜还包括数码摄像系统，现分述如下：

（一）机械装置

1．机架显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。

2．目镜筒位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定，目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。

3．物镜转换器它是一个旋转圆盘，上有3～5个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。

4．载物台是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。

5．调焦机构利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察物体对焦清晰成像。

6．聚光器调节机构聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。
（二）光学系统

1．目镜它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。

2．物镜它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体（如杉木油），它能显著的提高显微观察的分辨率。

3．光源有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。

4．聚光器包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度。

（三）数码摄像系统

1．摄像头

2．图像采集卡

3．软件

4．微机



五、光学显微镜的分类

光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。

1．双目体视显微镜

双目体视显微镜又称"实体显微镜"或"解剖镜"，是一种具有正象立体感地目视仪器。在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。它具有如下特点：

（1）利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角--体视角（一般为12度--15度），为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。

（2）象是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来的缘故。

（3）虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长。

（4）焦深大，便于观察被检物体的全层。

（5）视场直径大。

目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜----变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为"连续变倍体视显微镜"（Zoom-stereomicroscope）。随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。
2．金相显微镜

金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

3．偏光显微镜（Polarizingmicroscope）

偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

（1）偏光显微镜的特点

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。

（2）偏光显微镜的基本原理

偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。

（3）偏光镜检术的方式

a.正相镜检（Orthscope）:又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens）,被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

b.锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。

（4）偏光显微镜在装置上的要求

a.光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

b.目镜：要带有十字线的目镜。

c.聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

d.伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。

（5）偏光镜检术的要求

a.载物台的中心与光轴同轴。

b.起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

c.制片不宜过薄。
4．荧光显微镜

荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光显微镜广泛应用于生物，医学等领域。

（1）荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。

a.透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作。