生命科学中的FISH技术

荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH ）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊的荧光素标记 DNA 探针，在染色体、细胞或组织切片标本上进行 DNA 杂交，以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序列存在与否。近年来随着 FISH 所应用的探针种类的不断增多， FISH 技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤的诊断、基因定位等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在许多缺点，如每次检测需要重新进行标记，标记步骤繁琐，标记的探针不稳定，需要较长时间的曝光，并且对环境造成污染，在观察结果时，需要较多的细胞分裂相。此外，由于放射性银粒和染色体聚集在不同平面，可能引起计数上的误差。

与之比较， FISH 则具有其不可比拟的优点：
操作简便，一步式反应，能迅速得到结果，一次标记后可使用二年。
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。
在同一标本上，可同时应用几种不同探针，标记不同的颜色。
可用于分裂细胞和静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。

荧光原位杂交技术可以传统技术完美结合： FISH 和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种不同颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译的产物，有助了解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。 FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长，短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。

荧光信号在高压汞灯的短波激发光下，常引起荧光信号发生淬灭，为防止淬灭的发生，需要将 DAPI 或 PI 稀释于 P － Phenlenediomine 的甘油缓冲液中。对于单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察 FITC 、 TEXAS － RED 等多种颜色的 FISH 信号。不论是染色体还是单拷贝基因的 FISH 信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过 CCD （ chargecoupled device ）的照片系统或 LASER SCANNING IMAGING SYSTERM （激光扫描共焦成像系统）交摄取的信号储存在计算机内，经软件处理后，将信号叠加显示在荧光屏上。

由于有多种方法标记 DNA 探针，帮一次杂交可以同时观察多个探针的信号，如两个不同的探针分别用 BIOTIN 和 DIGOXIGENIN 标记，杂交后用 AVIDIN － FITC 和抗－ DIG － TEXAS － RED 分别与探针上的 BIOTIN 和 TEXAS － RED 信号。采用三种或三种以上不同的半抗原，如 BIOTIN 、 DIG 和 DNP 等标记探针，然后用多种不同颜色的荧光素，如 FITC （绿色）， RHODAMINE （红色）， CASCADE BLUE （兰色）等结合进行，可同时得到多种不同颜色的荧光信号。

同上于常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像，彩色胶片不易多曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用 DIGITAL IMAGING CAMERA SYSTEM 或 CCD 照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。

对已做过 G 显带的染色体片子，用 75 ％ 的乙醇或甲醇褪色后，可使 FISH 更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）。 FISH 和 G 显带技术结合，不仅可以用新近 G 带处理过的片子，而且还可用陈旧的 G 带片子。因些， FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做回顾性分析。

绿色荧光 FITC －激发光 495nm ，发射光 520nm

红色荧光罗丹明（ Rhodamine ）－激发光 565nm ，发射光 590nm

为得到最优的观察结果采用特异性单光谱带或三光谱带滤光片