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手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?

翌圣生物科技(上海)股份有限公司2021年9月15日 4:18 点击:1720

手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?

通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何评估RNA质量?》一文的学习。相信大家已经获得了优质的RNA,即将进入逆转录环节。

对于逆转录,大家都知道它是以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成互补DNA (complementary DNA,cDNA)的过程(如图1)。但对于过程中起关键作用的逆转录酶,可能比较陌生。接下来,让小翌给大家介绍下逆转录酶的相关理论知识。

图1. 逆转录过程示意图.png
图1. 逆转录过程示意图


逆转录酶的发现
1970年美国科学家Howard TeminDavid Baltimore分别在动物致癌RNA病毒中发现了逆转录酶,并因此获得了1975年诺贝尔生理学或医学奖。该发现揭示了生物体的遗传信息不仅可以从DNA到DNA(DNA自我复制)、从RNA到RNA、从DNA到RNA(转录),还可以从RNA到DNA(逆转录),进而补全了中心法则(如图2)。

图2. 中心法则示意图.png
图2. 中心法则示意图


逆转录酶的酶学特性

逆转录酶属于DNA聚合酶的一类,可以聚合dNTP合成cDNA链,这一过程的发生,依赖于逆转录酶的2大活性:DNA聚合酶活性和RNase H活性。

DNA聚合酶活性:以RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA的3′末端以5′→3′方向合成DNA。值得注意的是该酶不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,会导致DNA出错率比较高。
RNase H活性:DNA链容易与RNA链形成DNA-RNA杂交链,RNase H可以水解杂交链上的RNA。它是病毒生命周期中复制循坏所必需的,能限制逆转录酶的合成长度。


逆转录酶的种类
目前,市面上常用的两种逆转录酶:AMV和M-MLV。它们拥有着不同的特征,如表1所示。

表1. M-MLV和AMV逆转录酶的特征比较


M-MLV

AMV

来源

莫洛尼鼠白血病病毒

禽成髓细胞瘤病毒

热稳定性

差,37-42℃

好,42-55℃

最适pH

7.6

8.3

RNase H活性

cDNA合成得率

较高

合成长度

长,可达2-3kb

对抗复杂结构RNA的能力

优势

合成产物长度长、含量高

比M-MLV更耐热,适合具有一定复杂结构的RNA转录


虽然野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性差,抵抗复杂结构的RNA能力弱,但通过对其进行改造可弥补这些不足。渐渐地,改造后的M-MLV逆转录酶成为了市场的主流产品。


翌圣Hifair®逆转录酶

为了提高M-MLV的逆转录能力,翌圣生物在野生型M-MLV的基础上通过基因工程技术开发出了Hifair®系列逆转录酶,包括Hifair®Hifair®系列逆转录酶。

其中Hifair®系列逆转录酶cDNA合成速度快,且热稳定性高,可耐受高达60℃的反应温度,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。该酶缺失了RNaseH活性,提高了其延伸能力,其合成长度达19.8kb。此外,该酶增强了与模板的亲和力,非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。


产品选择指南


产品形式

产品名称和编号

引物

适用实验类型

产品特点

单酶

Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES

PCR/qPCR

A.逆转录条件:42℃,30min

总RNA使用范围:1ng-5μg

 合成cDNA长度:10kb

Hifair® III Reverse Transcriptase/11111ES

B.逆转录条件:55℃,15min

 总RNA使用范围:10pg-5μg

 合成cDNA长度:19.8kb

酶和buffer 分开

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES/11121ES

单独成管的oligodT、random primer

 

PCR/qPCR

 

同A

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11139ES

同B

酶和buffer预混

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES/11123ES

按比例预混的oligodT、random primer

qPCR

C.逆转录条件:42℃,30min

总RNA使用范围:1ng-5μg

2×预混液

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES

D.逆转录条件:55℃,15min

 总RNA使用范围:10pg-5μg

 4×预混液,可投入更大体积模板


Hifair®Ⅲ逆转录酶性能展示


 可耐受60℃反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录


图3. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板.png 
图3. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)在42℃-65℃下进行逆转录。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因(4.4kb)。M:1kb DNA ladder.


 优越的延伸性能,可合19.8kbcDNA


图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板.png

 
图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板,oligodT为引物,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因(19.9kb)的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.


 出色的逆转录效率,适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因


图5. 以300ng 293T细胞的总RNA为模板.png 
图5. 以300ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量(25-65%)、不同表达丰度的基因。


 线性检测范围广,Total RNA 10pg-5μg


图6. 以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板.png 
图6.以10pg-5μg293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。


相关产品

产品定位

产品名称

货号

规格

单酶

Hifair® II Reverse Transcriptase

11110ES92/93

1/5×10KU

高灵敏度单酶

Hifair® III Reverse Transcriptase

11111ES92/93

1/5×10KU

Kit

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11119ES60

100T

Kit(含gDNA去除步骤)

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit  (gDNA digester plus)

11121ES60

100T

高灵敏Kit(含gDNA去除步骤)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11139ES60

100T

预混液

Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix

11120ES60

100T

预混液(含gDNA去除步骤)

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)

11123ES60

100T

高灵敏预混液(含gDNA去除步骤)

Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60

100T


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已发表文献(部分)


[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.IF31.398

[2]. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493) 

[3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.IF 12.353

[4].  Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug  Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters,  2020.IF12.279

[5].  Xu L ,  Xu S ,  Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota  in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome,  2021, 9(1).(IF 11.607)

以上是小翌本期给大家分享的内容,主要介绍了逆转录酶的发现、酶学特性和种类。下期,我们将告诉大家应如何正确选择逆转录引物,我们下期不见不散哦~



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