手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?
- 翌圣生物科技(上海)股份有限公司2021年9月15日 4:18 点击:1720
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何评估RNA质量?》一文的学习。相信大家已经获得了优质的RNA,即将进入逆转录环节。
对于逆转录,大家都知道它是以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成互补DNA (complementary DNA,cDNA)的过程(如图1)。但对于过程中起关键作用的逆转录酶,可能比较陌生。接下来,让小翌给大家介绍下逆转录酶的相关理论知识。 逆转录酶属于DNA聚合酶的一类,可以聚合dNTP合成cDNA链,这一过程的发生,依赖于逆转录酶的2大活性:DNA聚合酶活性和RNase H活性。 表1. M-MLV和AMV逆转录酶的特征比较 M-MLV AMV 来源 莫洛尼鼠白血病病毒 禽成髓细胞瘤病毒 热稳定性 差,37-42℃ 好,42-55℃ 最适pH 7.6 8.3 RNase H活性 弱 强 cDNA合成得率 较高 低 合成长度 长,可达2-3kb 短 对抗复杂结构RNA的能力 弱 强 优势 合成产物长度长、含量高 比M-MLV更耐热,适合具有一定复杂结构的RNA转录 虽然野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性差,抵抗复杂结构的RNA能力弱,但通过对其进行改造可弥补这些不足。渐渐地,改造后的M-MLV逆转录酶成为了市场的主流产品。 为了提高M-MLV的逆转录能力,翌圣生物在野生型M-MLV的基础上通过基因工程技术开发出了Hifair®系列逆转录酶,包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆转录酶。 产品形式 产品名称和编号 引物 适用实验类型 产品特点 单酶 Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES 无 PCR/qPCR A.逆转录条件:42℃,30min 总RNA使用范围:1ng-5μg 合成cDNA长度:10kb Hifair® III Reverse Transcriptase/11111ES B.逆转录条件:55℃,15min 总RNA使用范围:10pg-5μg 合成cDNA长度:19.8kb 酶和buffer 分开 Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES/11121ES 单独成管的oligodT、random primer PCR/qPCR 同A Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11139ES 同B 酶和buffer预混 Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES/11123ES 按比例预混的oligodT、random primer qPCR C.逆转录条件:42℃,30min 总RNA使用范围:1ng-5μg 2×预混液 Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES D.逆转录条件:55℃,15min 总RNA使用范围:10pg-5μg 4×预混液,可投入更大体积模板 ◎ 可耐受60℃反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录 ◎ 优越的延伸性能,可合成19.8kb的cDNA ◎ 出色的逆转录效率,适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因 ◎ 线性检测范围广,Total RNA 10pg-5μg 产品定位 产品名称 货号 规格 单酶 11110ES92/93 1/5×10KU 高灵敏度单酶 11111ES92/93 1/5×10KU Kit 11119ES60 100T Kit(含gDNA去除步骤) Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) 11121ES60 100T 高灵敏Kit(含gDNA去除步骤) Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) 11139ES60 100T 预混液 11120ES60 100T 预混液(含gDNA去除步骤) Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) 11123ES60 100T 高灵敏预混液(含gDNA去除步骤) Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) 11141ES60 100T ▲ 点击查看产品详情 [1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.(IF31.398) [2]. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493) [3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.(IF 12.353) [4]. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.(IF12.279) [5]. Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607) 干货分享 | 一文全面解读迷之又迷的260/280、260/230
图1. 逆转录过程示意图
图2. 中心法则示意图
图3. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)在42℃-65℃下进行逆转录。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因(4.4kb)。M:1kb DNA ladder.
图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板,oligodT为引物,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因(19.9kb)的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
图5. 以300ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量(25-65%)、不同表达丰度的基因。
图6.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。化繁为简!小翌带你轻松搞定qPCR数据分析
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