干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗？

干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗？

王老师：您好，最近用你们的试剂跑qPCR，复孔平台期的荧光信号不同，这样的结果能用吗？

小翊：您好，老师。从图中来看，复孔重复性是比较好的，△Ct值<0.5, 这个结果没什么问题的。

王老师：那为什么复孔的平台期信号还有相差呢？有什么方法可以使复孔荧光信号一致吗？

最近有不少客户咨询小翊类似的问题，担心这样的数据不可靠今天小翊就帮您解除疑虑！

复孔平台期不同不会影响实验结果（△Ct<0.5）

众所周知，理想的PCR扩增是使DNA分子由1变2，2变4，以2ⁿ进行扩增的。但实际上，随着循环数的增加，体系中的Taq酶、dNTP、引物等逐渐被消耗并伴随着副产物的生成，使得PCR不能呈指数扩增，从而使实际的扩增曲线呈现“S”型，通常分为基线期、指数增长期和平台期三个阶段，如图1。

基线期是指PCR最开始的3-15个循环时期，这段时期扩增是存在的，但因循环次数较少，体系中双链DNA积累较少，荧光信号强度没有超过荧光本底信号，此时的荧光值对于机器来说很难准确检测。指数扩增期是指PCR产物的量增长最快的一个时期，理想条件下，是呈指数增长的，在这个时期由于样品间的细小误差尚未放大，所以复孔的荧光信号在这个时期相对一致。通常荧光阈值需要设置在此时期，荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数称之为Ct值，故各复孔间的Ct值有较好的重复性（△Ct＜0.5）。而平台期是指由于原料耗尽、反应副产物的产生等原因使得扩增变得缓慢的一个时期。此时期经过的循环次数较多，使样品间的细小差异被无限放大，从而导致复孔间平台期的荧光信号相差很大。

图1 扩增曲线的三个阶段

下面为大家展示一个案例，以293T-cDNA的20倍稀释液为模板，扩增GAPDH基因，90个复孔（如图2）。

图2 同一样品的90个重复的扩增曲线图

由图可以看出该实验的复孔重复性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE标准。但平台期的荧光信号值均有差异。

综上：数据的有效性和复孔平台期荧光信号关系不大，主要与复孔间的△Ct有关，MIQE标准是△Ct＜0.5。

在复孔△Ct<0.5的情况下，复孔平台期不同并不影响实验结果，但是有没有办法可以让复孔平台期荧光信号尽量一致呢？

使复孔平台期荧光信号趋于一致的秘诀

1、确保加样的准确性

1）qPCR各组分完全化冻需要混匀。

2）采用预混的方式进行加样，保证体系的均一性。可以将除模板以外的试剂进行预混，分注至各管中。

3）模板浓度高时，可将模板稀释，提高加样体积，减少加样误差。

2、确保移液的精准度

加样过程需确保移液枪未出现漏气、漏液的情况，避免使用精准度差的移液枪或者不配套的枪头。

3、体系混匀并进行离心

体系加完后要用移液枪吹打并进行离心，以防试剂挂壁或者体系中有气泡造成实验结果不准确。

4、qPCR试剂的选择：选择“预混液”形式的qPCR试剂，反应体系只需加入引物和模板，大大简化实验的操作步骤，减少了加样误差。

好了，读到这里，您应该不会再用纠结复孔平台期荧光信号不同的事了吧？为了简化您的qPCR实验操作，让您的qPCR数据更完美，小翊为您推荐一款SYBR Green预混液：Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat NO.11184ES），该产品是预混液形式的qPCR试剂，另外适合于所有的qPCR仪器平台（如图3），兼容快速程序，可以大大简化您的实验操作并能保证您实验结果准确性。

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