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得不到阳性克隆?可能是忽视了这些细节……

上海翊圣生物科技有限公司2019年6月10日 17:09 点击:1372

得不到阳性克隆?可能是忽视了这些细节……

过去,提起分子克隆载体构建这两个词,大家可能最先想到的是传统酶切酶连法,即用限制性内切酶产生黏性末端,通过碱基互补配对,连接两个片段的克隆方法。

近年来,同源重组技术逐渐受到科研人员的欢迎,如翊圣Hieff Clone®一步法快速克隆技术。相比之下,同源重组技术操作更加简单,不受到酶切位点的限制,可一次进行多个片段的拼接,大大的提高了克隆效率。

虽然同源重组技术操作简单,但毕竟实验过程是环环相扣的,一旦某个细节处理不好,都可能导致实验失败。为此,小编精心整理了同源重组实验的常见问题,并给出了可能的原因和解决方案。希望新手们在遇到类似问题时可快速判断可能的原因,节省时间,更顺利的完成实验。

常见问题分类:

 无克隆。

 假阳性。

 菌落PCR无条带。

 酶切鉴定多条带。

无克隆

出现无克隆的现象,可能的原因主要是连接不成功或连接成功,但转化失败。具体原因分别如下:

1、 连接不成功。

可能原因

解决方法

1)引物设计错误。

1)设计原则:同源臂(15-25 bpGC含量40-60%+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。

2)判断方法:可用翊圣无缝克隆引物设计软件核对,链接:http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/

2)载体与目的片段使用比例失调。

1)载体和目的片段浓度测定方法:常用吸光度法或琼脂糖电泳法。

2)载体与目的片段添加比例:

单片段建议:最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3,载体使用量为0.03 pmol;目的片段使用量为0.06-0.09 pmol

多片段建议:最适DNA使用量为每片段(含线性化载体)0.03 pmol

3)载体与目的片段不纯。

1)推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。

2)纯化产物建议溶解在pH8.0ddH2O中保存。

3)若为未纯化的DNA,加入总体积不超过反应体系体积1/5

4)操作问题或试剂盒失效。

建议做试剂盒附带的阳性对照实验。判断方法:

1)若阳性对照有克隆并检测为阳性,则排除试剂盒问题。

2)若阳性对照无克隆,可能是操作问题或试剂盒失效,建议换其他人或换试剂盒进行阳性对照实验,进一步确定问题。

2、 连接成功,但无克隆。

可能原因

解决方法

1)感受态细胞效率低,<107 cfu/μg

建议用转化效率大于107 cfu/μg的感受态细胞。

判断方法:可转化0.1ng质粒(如PUC19),观察克隆数,若生长大于1000个菌斑,则转化效率大于107 cfu/μg

2)抗生素种类错误。

建议将未线性化载体转化涂板。

判断方法:若未长克隆,则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。

假阳性

出现假阳性的情况,主要表现有两种,克隆不含插入片段或含有错误的插入片段。具体原因分别如下:

1、克隆不含插入片段(空载)。

可能原因

解决方法

1)载体线性化不完全。

建议将已制备的线性化的载体转化涂板。  

判断方法:如果长克隆较多,则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。

2)体系中混入了相同抗性的环状质粒。

1)产生原因:

以反向PCR方式进行载体线性化,残留环状质粒模板导致。

目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒,残留环状 质粒模板导致。

2)判断方法:将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板,如果长克隆较多,则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用DpnI 消化模板后,再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理,去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。

2、克隆含有错误的插入片段。

可能原因

解决方法

1PCR产物混有非特异扩增产物。

1)可能情况:PCR扩增目的基因时有非特异条带出现,未进行胶回收纯化。

2)解决方案:

优化PCR体系,提高特异性;

胶回收PCR产物;

鉴定更多的克隆。

2)片段缺失。

1)可能情况:载体或片段有多个同源重复序列。

2)解决方案:借助网站或软件进行序列比对(如NCBIVector NTI等)。

菌落PCR无条带

出现菌落PCR无条带的现象,可能与PCR扩增或重组连接有关,具体原因分别如下:

可能原因

解决方法

1)菌落PCR引物错误。

建议用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物。

2PCR体系或程序不合适。

1)可能情况:用目的片段引物和载体通用引物扩增都无产物。

2)解决方案:

优化PCR体系、程序;

提取质粒,以质粒做模板PCR验证;

换酶切法鉴定克隆。

3)连接失败。

1)判断方法:目的引物或一端载体通用引物,另一端目的引物扩增无条带,但载体通用引物扩增有条带,且大小符合空载。

2)可能原因:载体线性化不完全。建议优化酶切体系。

酶切鉴定多条带

可能原因

解决方法

重组载体上有多个相同的酶切位点。

1)换其他酶切位点进行酶切鉴定;

2)更换克隆鉴定方法,如换成菌落PCR或测序鉴定。

 

以上同源重组的常见问题您中枪过吗?若有,快来对号入座吧。如果还有其它更多关于一步法快速克隆的问题,欢迎留言或来电。

 

如果您之前在用传统酶切酶连技术,现对高效的同源重组技术跃跃欲试,那赶快行动起来吧!基于同源重组的Hieff Clone®一步法快速克隆试剂盒可以免费试用哦,点击http://ilgkldpz1pfv7fpa.mikecrm.com/y3LklB0

 

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(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


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