抚生试剂-分析ELISA试剂盒的操作步骤验开始前步骤

分析ELISA试剂盒的操作步骤验开始前步骤

       请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul（在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100ul，37℃，60分钟。

5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。

1. 每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。

3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板长时间处于干燥状态。

4. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

5. 在储存和温育时避免强光直接照射。

6. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10ul），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；检测液A、B，以及底物溶液在使用前，应置于37℃温育30分钟；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。